一种用于BaxmRNA检测的拉曼-荧光双模式纳米探针及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种用于Bax mRNA检测的拉曼

【技术实现步骤摘要】
一种用于Bax mRNA检测的拉曼
‑
荧光双模式纳米探针及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于纳米材料和生命科学
，尤其涉及一种用于Bax mRNA检测的拉曼
‑
荧光双模式纳米探针及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又名呕吐毒素，属于单端孢霉烯族类化合物，主要由禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、雪腐镰刀菌等镰刀菌产生，在自然界中广泛存在于小麦、大麦、玉米等粮食及其制品中，是最常见的真菌毒素之一。中国传统饮食习惯中粮谷比例远远高于西方，使得DON的危害更为突出。DON具有很强的细胞毒性，可以抑制DNA、RNA和蛋白质的合成，抑制线粒体功能并诱导细胞凋亡。其中诱导细胞凋亡是DON发挥致病作用，产生免疫毒性的重要途径之一，也是近年来霉菌毒素研究领域中的热点问题。
[0003]细胞凋亡主要通过三条途径发生：死亡受体信号通路、线粒体介导的细胞凋亡信号转导途径以及内质网介导的细胞凋亡信号转导途径。研究表明线粒体是单端孢霉烯族毒素毒性作用的靶细胞器。单端孢霉烯族毒素可诱导线粒体产生过多的ROS，激活线粒体凋亡途径。
[0004]线粒体凋亡途径由促进凋亡和抑制凋亡的两类基因共同控制，目前研究聚焦于Bcl
‑
2家族。Bax是Bcl
‑
2家族中参与细胞凋亡的一个成员，当诱导凋亡时，其高表达可拮抗Bcl
‑
2对细胞的保护效应而使细胞趋于死亡。研究表明，Bax是极关键的促细胞凋亡因子之一，因此，了解Bax mRNA在细胞通路中的作用并追踪其在细胞内的动态变化是非常必要的。
[0005]目前，细胞内Bax mRNA的测定方法包括RT
‑
PCR和琼脂糖凝胶电泳法、Northernblot分子杂交技术、原位杂交法、实时荧光定量PCR等。电泳法条带易染色，图谱清晰，分辨率高，重复性好，样品易洗脱，便于定量测定，但机械强度差，易破碎，易被污染，而且配制凝胶时所用的EB是有一定毒性的，实验时需注意。Northern blot分子杂交技术技术相对简单，成本较低，主要检测RNA表达数量，无法得知其在细胞组织中的分布情况。原位杂交法主要可以检测到RNA表达的分布情况，但技术复杂、步骤较为繁琐、试验费用较高。而实时荧光定量PCR法因能实时监测PCR反应的进程，有效地解决传统定量只能终点检测的局限而被广泛使用，但其对实验操作人员要求较高，步骤繁琐，对提取RNA样品有纯度要求。
[0006]表面增强拉曼光谱(Surface
‑
enhanced Raman Spectroscopy，SERS)是一种分子振动光谱技术，它通过构建SERS增强基底，即把分子吸附在粗糙金属或金属溶胶颗粒表面上，可将其拉曼信号强度放大十几个数量级，从而获得丰富的分子结构特征和物质成分信息。对于细胞和组织等生物样品来说是一种理想的无损分析手段。由于具有优异的光学性质、生物相容性和低毒性，金纳米材料在构建表面拉曼光谱散射或荧光生物传感器方面具有广阔的发展前景。近年来，借助新型识别分子，例如功能核酸，将其与纳米材料结合，能广泛应用于细胞内检测及原位成像。SERS技术虽具有高灵敏度，但较易被外界物质干扰造成假阳性信号，因此开发高特异性高稳定性SERS探针仍需深入研究探索。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的不足，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种用于Bax mRNA检测的拉曼
‑
荧光双模式纳米探针及其制备方法与应用。本专利技术的一种双模式纳米探针，包括纳米金三角片、Bax mRNA特异性识别链和锚定链、甲氧基聚乙二醇硫醇(SH
‑
mPEG)、细胞穿膜肽(TAT)，所述Bax mRNA特异性识别链和锚定链、甲氧基聚乙二醇硫醇(SH
‑
mPEG)、细胞穿膜肽(TAT)包裹在纳米金三角片表面；锚定链和酶识别链部分互补；识别链的5
’
端或3
’
端修饰荧光基团，锚定链的5
’
端或3
’
端修饰巯基；锚定链通过Au
‑
S共价键与纳米金三角片连接。
[0008]本专利技术通过以下技术方案实现的：
[0009]本专利技术的第一个目的在于提供一种用于Bax mRNA检测的拉曼
‑
荧光双模式纳米探针，所述拉曼
‑
荧光双模式纳米探针包括锚定链、与所述锚定链互补配对的Bax mRNA特异性识别链以及纳米金三角片；所述锚定链通过Au
‑
S共价键与纳米金三角片连接；所述锚定链的5
’
端或3
’
端修饰巯基；所述Bax mRNA特异性识别链的5
’
端或3
’
端修饰荧光基团。
[0010]本专利技术的锚定链、SH
‑
mPEG和TAT牢固地包裹在纳米金三角片表面，阻止纳米金三角片之间的相互接触和聚集，TAT小分子补充占据锚定链和SH
‑
mPEG未占据的位点，提高双模式纳米探针的稳定性，使其更易进入细胞。
[0011]在本专利技术的一个实施例中，所述锚定链的核酸序列为5
’‑
SH
‑
AAAAAACCCTGGACCCGGTGCCTCAG
‑3’
；
[0012]所述Bax mRNA特异性识别链的核酸序列为5
’‑
CATCCTGAGGCACCGGGTCCAGGGT
‑3’
。
[0013]在本专利技术的一个实施例中，所述荧光基团选自Cy5、Cy5.5、Cy3或ROX。
[0014]在本专利技术的一个实施例中，所述纳米金三角片的粒径为60nm
‑
80nm；在金的尖锐处能产生很高的电场效应，具有很好的表面增强拉曼效应。
[0015]在本专利技术的一个实施例中，所述锚定链、Bax mRNA特异性识别链和纳米金三角片的金的摩尔比为9
‑
10:2
‑
4:510
‑
520。
[0016]本专利技术的第二个目的在于提供一种所述的拉曼
‑
荧光双模式纳米探针的制备方法，包括以下步骤：
[0017](1)将活化后的锚定链与经表面配体稳定后的纳米金三角片混合反应，加入氯化盐孵育，得到含锚定链的纳米金三角片；
[0018](2)将步骤(1)所述的含锚定链的纳米金三角片与Bax mRNA特异性识别链溶液混合孵育，固液分离取固相，将所得固相重悬于缓冲液中，并加入细胞穿膜肽继续孵育，固液分离取固相，得到所述拉曼
‑
荧光双模式的纳米探针。
[0019]在本专利技术的一个实施例中，步骤(1)中，所述活化后的锚定链溶液通过以下方法制备得到：向锚定链溶液中加入硫醇类还原剂进行反应，得到所述活化后的锚定链溶液。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于Bax mRNA检测的拉曼
‑
荧光双模式纳米探针，其特征在于，所述拉曼
‑
荧光双模式纳米探针包括锚定链、与所述锚定链互补配对的Bax mRNA特异性识别链以及纳米金三角片；所述锚定链通过Au
‑
S共价键与纳米金三角片连接；所述锚定链的5
’
端或3
’
端修饰巯基；所述Bax mRNA特异性识别链的5
’
端或3
’
端修饰荧光基团。2.根据权利要求1所述的拉曼
‑
荧光双模式纳米探针，其特征在于，所述锚定链的核酸序列为5
’‑
SH
‑
AAAAAACCCTGGACCCGGTGCCTCAG
‑3’
；所述Bax mRNA特异性识别链的核酸序列为5
’‑
CATCCTGAGGCACCGGGTCCAGGGT
‑3’
。3.根据权利要求1所述的拉曼
‑
荧光双模式纳米探针，其特征在于，所述荧光基团选自Cy5、Cy5.5、Cy3或ROX。4.根据权利要求1所述的拉曼
‑
荧光双模式纳米探针，其特征在于，所述锚定链、Bax mRNA特异性识别链和纳米金三角片的金的摩尔比为9
‑
10:2
‑
4:510
‑
520。5.如权利要求1中所述的拉曼
‑
荧光双模式纳米探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将活化后的锚定链与经表面配体稳定...

【专利技术属性】
技术研发人员：马小媛，林茜池，徐珊，李晨彪，王周平，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：