一种利用解脂耶氏酵母高产斑蝥黄的培养基组合和发酵工艺制造技术

本发明专利技术涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种利用解脂耶氏酵母高产斑蝥黄的培养基组合和发酵工艺。培养基组合中斜面培养基包括麦芽膏粉100

【技术实现步骤摘要】
一种利用解脂耶氏酵母高产斑蝥黄的培养基组合和发酵工艺


[0001]本专利技术涉及微生物发酵
，具体涉及一种利用解脂耶氏酵母高产斑蝥黄的培养基组合和发酵工艺。

技术介绍

[0002]斑蝥黄是一种重要的类胡萝卜素，为深紫色晶体或结晶性粉末，对氧及光不稳定，需贮存于充惰性气体的遮光性容器内。斑蝥黄在自然界生物体内广泛存在，因其着色效果好，故而常作为食品、饲料、化妆品等中的着色剂使用。同时斑蝥黄还因其生理功能而广泛应用于医学领域，斑蝥黄与维生素E、虾青素、β
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胡萝卜素等在对自由基的淬灭作用方面相类似，但效果是β
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胡萝卜素的近两倍，是维生素E的五十倍，又称为超级维生素E。其能够提高免疫力、延缓衰老、预防老年疾病，甚至具有一定的抗癌功效。
[0003]斑螯黄的获取方法主要有天然原料提取、化学合成和生物发酵生产。由于各类物种体内的斑蝥黄含量都非常微量，无法通过人工提取的方法大量生产；目前工业生产中主要采用化学合成生产：包括全化学合成法和β
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胡萝卜素氧化法。全化学合成法制备斑蝥黄路线过长，成本普遍较高；β
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胡萝卜素氧化法是利用β
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胡萝卜素为原料进行一步氧化的方法，相较而言具有操作方便、设备简单等特点，是工业化生产斑蝥黄的主要方法，β
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胡萝卜素一步氧化法分为固相研磨法和双液相氧化法。生物发酵生产β
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胡萝卜素则克服了以上两种方法的缺点，具有生产工艺简单、周期短、成本低、产品质量好等优点。但是生物发酵法要先得到合适的高产菌株，再通过发酵工艺开发使其高效生产。目前尚无发酵法生产斑蝥黄的其他公开报导。

技术实现思路

[0004]针对目前缺少通过发酵工艺高效生产斑螯黄方法的技术问题，本专利技术提供一种利用解脂耶氏酵母高产斑蝥黄的培养基组合和发酵工艺，可在100L发酵罐上实现发酵效价5g/L的较高水平，具有广泛的工业化应用前景。
[0005]第一方面，本专利技术提供一种利用解脂耶氏酵母高产斑蝥黄的培养基组合，包括斜面培养基、种子培养基和发酵培养基；其中，斜面培养基包括麦芽膏粉100
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190g/L，琼脂15
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20g/L，氯霉素0.05
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0.2g/L；种子培养基包括葡萄糖5
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15g/L，大豆蛋白胨5
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20g/L，硝酸钾1
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10g/L，硫酸铵2
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12g/L，磷酸二氢钾2
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10g/L；发酵培养基包括葡萄糖120
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300g/L，蛋白胨15
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45g/L，玉米浆5
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20g/L，硫酸铵2
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12g/L，硫酸镁1
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6g/L，硫酸锰1
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6g/L，菜籽油20
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110g/L。
[0006]进一步的，斜面培养基包括麦芽膏粉130g/L，琼脂20g/L，氯霉素0.1g/L；种子培养基包括葡萄糖15g/L，大豆蛋白胨10g/L，硝酸钾2g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾3g/L；发酵培养基包括葡萄糖260g/L，蛋白胨30g/L，玉米浆10g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁
locus. NucleicAcids Res. 2001,29（12）:E59），其中URA3（genebank登录号：AJ306421）由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成，并在其两端加上hisG序列（genebank登录号：AF324729），插入pUC57载体获得pUC
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HUH。
[0019]本专利技术所使用的GGS1基因（多核苷酸序列如SEQ ID NO:84所示）、tHMGR（多核苷酸序列如SEQ ID NO:85所示）启动子TEFp、EXPp、GDPp及终止子PEXt、XPRt、LIPt等均来源于解脂耶氏酵母MYA
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2613，通过PCR方法获得。
[0020]实施例1 解脂耶氏酵母基因工程菌MC
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CTX4的构建以解脂耶氏酵母MC209为出发菌株，解脂耶氏酵母MC209为中国专利申请CN202210057473.X记载的MC
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3RP
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GH
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FOA菌株，该菌株是以购自ATCC的解脂耶氏酵母MYA
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2613为出发菌株，经导入拷贝的卷枝毛霉β
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胡萝卜素合成基因carB及carRP，并增强解脂耶氏酵母牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）合成酶基因GGS1及截短形式的HMG
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CoA还原酶基因tHMGR的表达获得的，解脂耶氏酵母MC209已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年11月08日，保藏编号为CGMCC No.23758。
[0021]首先分别将两个不同的BSW重组质粒导入解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）MC209细胞中，然后通过同源臂的同源重组整合到解脂耶氏酵母MC209染色体上，然后依次将重组质粒pMD
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H7BRP、重组质粒pMD
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H8GH转入菌株中，即得解脂耶氏酵母基因工程菌。具体步骤如下：S1 重组质粒pMD
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H1BRP的制备以解脂耶氏酵母MYA
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2613染色体为模板，利用引物H1U
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F/R（SEQ ID NO:1~2）、H1D
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F/R（SEQ ID NO:3~4）扩增染色体上的同源臂序列，并通过重叠PCR将两者相连插入pMD19
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T simple载体获得pMD
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H1质粒；以解脂耶氏酵母MYA
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2613染色体为模板，利用引物TEF1
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F/R（SEQ ID NO:5~6）、PEX1
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F/R（SEQ ID NO:9~10）分别扩增启动子TEFp及终止子PEXt；以pUC
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CB为模板，利用引物CB1
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F/R（SEQ ID NO:7~8）扩增carB基因；然后通过重叠PCR构建TEFp
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carB
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PEXt模块；以解脂耶氏酵母MYA
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2613染色体为模板，利用引物EXP1
‑
F/R（SEQ ID NO:11~12）、XPR1
‑
F/R（SEQ ID NO:15~16）分别扩增启动子EXPp及终止子XPRt；以pUC
‑
CRP为模板，利用引物CRP1
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F/R（SEQ ID NO:13~14）扩增carRP基因；然后通过重叠PCR构建EXPp
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carRP
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用解脂耶氏酵母高产斑蝥黄的培养基组合，其特征在于，包括斜面培养基、种子培养基和发酵培养基；其中，斜面培养基包括麦芽膏粉100
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190g/L，琼脂15
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20g/L，氯霉素0.05
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0.2g/L；种子培养基包括葡萄糖5
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15g/L，大豆蛋白胨5
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20g/L，硝酸钾1
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10g/L，硫酸铵2
‑
12g/L，磷酸二氢钾2
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10g/L；发酵培养基包括葡萄糖120
‑
300g/L，蛋白胨15
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45g/L，玉米浆5
‑
20g/L，硫酸铵2
‑
12g/L，硫酸镁1
‑
6g/L，硫酸锰1
‑
6g/L，菜籽油20
‑
110g/L。2.如权利要求1所述的培养基组合，其特征在于，斜面培养基包括麦芽膏粉130g/L，琼脂20g/L，氯霉素0.1g/L；种子培养基包括葡萄糖15g/L，大豆蛋白胨10g/L，硝酸钾2g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾3g/L；发酵培养基包括葡萄糖260g/L，蛋白胨30g/L，玉米浆10g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁2.5g/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈正杰，方毅，刘敏，
申请(专利权)人：山东微研生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：