一种促进杜鹃兰属植物种子萌发的菌株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种促进杜鹃兰属植物种子萌发的菌株及其应用，所述菌株为杜鹃兰块茎共生菌中分离筛选所得，所述菌株经ITS测序鉴定为镰孢菌属真菌，分类学名称为Fusariumsp，其保藏编号为GDMCCNO：61880。所述菌株与杜鹃兰属植物种子拌种栽培试验结果表明，能够促进其种子萌发，提高种子萌发菌，缩短萌发时间，在杜鹃兰属植物育苗中有很高的价值和作用，也是镰孢菌属真菌首次在兰科植物育苗上的应用，解决了杜鹃兰属植物的规模化育种和栽培关键性的难题。和栽培关键性的难题。和栽培关键性的难题。

【技术实现步骤摘要】
一种促进杜鹃兰属植物种子萌发的菌株及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种促进杜鹃兰属植物种子萌发的菌株及其应用。

技术介绍

[0002]杜鹃兰(学名：Cremastra appendiculata(D.Don)Makino)，假鳞茎卵球形或近球形，密接，有关节，外被撕裂成纤维状的残存鞘。叶通常1枚，生于假鳞茎顶端，狭椭圆形、近椭圆形或倒披针状狭椭圆形。花葶从假鳞茎上部节上发出，近直立；总状花序长10
‑
25厘米，具5
‑
22朵花；花瓣倒披针形或狭披针形，向基部收狭成狭线形，先端渐尖；唇瓣与花瓣近等长，线形。蒴果近椭圆形，下垂。花期5
‑
6月，果期9
‑
12月。生于林下湿地或沟边湿地上，海拔1000
‑
2900 米。
[0003]杜鹃兰具有清热解毒、化痰散结的功效，现代临床上配伍应用于抗肿瘤、抗菌、降压、抗痛风、致突变性、抗血管生成活性、毒覃碱M 3受体阻断作用、抗血管生成的活性，在市场上具有很大的开发潜力。杜鹃兰巨大的药用价值和园艺价值，市场需求量大。但是由于长期遭受掠夺式采挖，且自身生殖机制的限制，使得杜鹃兰的栽培成活率低、繁殖周期长，进而造成杜鹃兰资源濒临枯竭。
[0004]杜鹃兰种子细小，没有胚乳，自然生长过程中很难直接萌发，萌发率极低，一般只有0
‑
0.01％。目前杜鹃兰主要靠假鳞茎的无性繁殖、蒴果种子的组织培养、蒴果种子的直播方式进行繁育，这几种方法的繁殖率都较低，因此一直限制了杜鹃兰的扩大栽培。
[0005]由此可见，如何提高其种子萌发率是解决育苗成功率和稳定率的关键。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术的目的之一是提供一株促进杜鹃兰属植物种子萌发的菌种 TCM
‑
1，以解决杜鹃兰属植物种子萌发率低的问题。
[0007]本专利技术通过以下技术手段解决上述技术问题：
[0008]一株促进杜鹃兰属植物种子萌发的菌种天乐萌发菌1号(TCM
‑
1)，所述菌株TCM
‑
1为镰孢菌属真菌，分类学名称为Fusarium sp.，该菌株于2021年8月 23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号为GDMCC NO：61880，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
[0009]进一步，所述伴生菌株的ITS序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
[0010]5’‑
TCACTTCAGAAGAGTTGGGTGTTTTACGGCGTGGCCGCGCCGCTCTCCAGTCGCGAGGTGTTAGC TACTACGCGATGGAAGCTGCGGCGGGACCGCCACTGTATTTGGGGGACGGCGTGTGCCCACGGGGGGCT CCGCCGATCCCCAACGCCAGGCCCGGGGGCCTGAGGGTTGTAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCA GAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTT ATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAATTTATT TGCTTGTTTTACTCAGAAGAAACATTATAGAAACAGAGTTAGGGGTCCTCTGGCGGGGGCGGCCCGTTT CACGGGGCCGTCTATTCCCGCCGAAGCAAC
GTTTAGGTATGTTCAC
‑3’
[0011]进一步，本专利技术的目的之二是提供所述菌株的具体分离纯化方法。
[0012]所述菌株从野生的杜鹃兰小苗块茎分离得到，经过纯化、伴种试验筛选所得。所述菌株的具体分离纯化方法为：
[0013]于贵州省毕节市大方县普底乡红丰村地方采集野生杜鹃兰小苗的假鳞状块茎，将采集的块茎在清水中洗净泥土和杂质，沥干水分，在超净工作台下先在 75％乙醇中浸泡15s，无菌水漂洗3
‑
5次，再在0.1％升汞中浸泡1
‑
2s，无菌水漂洗3
‑
5次。用解剖刀将块茎切成5mm
×
5mm
×
5mm的小块，用无菌滤纸吸干水滴，每个平板放入5块，置于分离培养基中培养，共培养50块块茎。将平板置于25℃培养箱、中黑暗培养14
‑
28天。待菌落从块茎中长出，用接种针挑取菌丝置PDA 培养基上，培养7d后观察菌落形态的一致性和均匀性，若菌落形态有差异，进行第二次分离，如此反复直至纯化获得纯培养菌落。分离培养基为马丁
‑
孟加拉红培养基制备方法为：葡萄10g、胰蛋白胨5g、K2HP041 g、MgSO4·
7H200.5 g、孟加拉红0.033g、琼脂20g，蒸馏水定容至1000mL，pH 5.0；马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)制备方法：马铃薯200g，切碎加水煮沸20min后过滤，在马铃薯汁中加入琼脂15g充分溶解，再加入葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000 mL。所用试剂均为市售试剂。
[0014]所述菌株的鉴定方法为：
[0015]形态观察，所述伴生菌株的菌落形态为：平皿中菌丝白色，呈绒毛状；液体培养菌丝球不规则球形或椭圆形，直径0.4
‑
0.5mm；原种和栽培种菌丝为白色，菌丝稀疏，绒毛状。(见图1
‑
4)
[0016]分子鉴定，(1)真菌基因组DNA提取
[0017]用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的基因组DNA抽提试剂盒提取菌株的基因组DNA，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度、纯度与完整性。
[0018](2)PCR反应体系
[0019]核糖体DNA的ITS区域通用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物系列为：ITS1 5
′‑
TCCGTAGGTGAACCTGCGG
‑3′
， ITS4 5
′‑
TCCTCCGCTTATTGATATGC
‑3′
。
[0020]PCR反应体系：Template(基因组DNA20
‑
50ng/μl)0.5μl、10
×
Buffer(With Mg
2+
)2.5μl、dNTP(各2.5mM)1μl、酶0.2μl、引物F(10uM)0.5μl、引物R(10 uM)0.5μl、加双蒸H2O至25μl。
[0021]PCR循环条件为：94℃预变性4min，(94℃45sec，55℃45sec，72℃1min)30 个循环，72℃修复延伸10min，4℃终止反应。
[0022]凝胶电泳：用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测反应产物浓度及PCR扩增片段大小，150V、100mA2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种促进杜鹃兰属植物种子萌发的伴生菌株，其特征在于，所述菌株为镰孢菌属真菌，于2021年8月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号为GDMCC NO：61880。2.根据权利要求1所述的一种促进杜鹃兰属植物种子萌发的伴生菌株，其特征在于，所述伴生菌株的ITS序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的一种促进杜鹃兰属植物种子萌发的伴生菌株，其特征在于，所述伴生菌株的菌落形态为：平皿中菌丝白色，呈绒毛状；液体培养菌丝球不规则球形或椭圆形，直径0.4
‑
0.5mm；原种和栽培种菌丝为白色，菌丝稀疏，绒毛状。4.如权利要求1所述的促进杜鹃兰属植物种子萌发的伴生菌株的制备方法，其特征在于，所述伴生菌株从野生的杜鹃兰小苗块茎分离得到，经过纯化、伴种试验筛选所得。5.如权利要求1
‑
4任意一项所述的伴生菌株在促进杜鹃兰属植物种子萌发上的应用。6.如权利要求1
‑
4任意一项所述的伴生菌株在促进杜鹃兰属植物种子萌发形成幼苗上的应用，所述幼苗是指种子萌发形成至少一个叶片。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤，S1：制备固定菌床，于9
‑
10月份，在郁闭度0.2
‑
0.5的树林下制备固定菌床，挖育苗坑，先在坑底均匀撒拨保藏编号为GD...

【专利技术属性】
技术研发人员：张光远，欧跃平，刘鹏，
申请(专利权)人：贵州天乐菌业科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：