一种储粮害虫赤拟谷盗高抗性种群地理区系的鉴定方法技术

本发明专利技术提供一种储粮害虫赤拟谷盗高抗性种群地理区系的鉴定方法，涉及粮食储藏技术、农业昆虫与害虫防治领域。该鉴定方法，通过检测二氢硫辛酰胺脱氢酶的氨基酸或者核苷酸序列鉴定储粮害虫赤拟谷盗高抗性种群地理区系。本发明专利技术鉴定方法，具备方法简便、精准、高效的特点。点。点。

【技术实现步骤摘要】
一种储粮害虫赤拟谷盗高抗性种群地理区系的鉴定方法


[0001]本专利技术涉及粮食储藏技术、农业昆虫与害虫防治领域，具体涉及一种储粮害 虫赤拟谷盗高抗性种群地理区系的鉴定方法。

技术介绍

[0002]储粮害虫是造成粮食数量和质量损失重要生物因素之一。粮食仓储稳定环境 和食物充足为其生长繁殖提供理想温床。对储粮害虫的防治方法包含物理防治、 化学防治、生物防治和生态防治。在深入开展储粮害虫生物学、基因遗传、抗性 机理解析、新型药剂杀虫机制等科学研究中，常常难以保障所用供试昆虫遗传信 息的单一来源、遗传稳定，尤其是不同地理区系的试虫相互污染问题，给生物防 治工作和科学研究带来极大阻碍，急需建立储粮害虫高抗性种群地理区系的判别 方法。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种储粮害虫赤拟谷盗高抗性种群地理区系的鉴定方 法，具备方法简便、精准、高效的特点。
[0004]本专利技术的目的采用如下技术方案实现：
[0005]一种储粮害虫赤拟谷盗高抗性种群地理区系的鉴定方法，通过检测二氢硫辛 酰胺脱氢酶的氨基酸或者核苷酸序列鉴定储粮害虫赤拟谷盗高抗性种群地理区 系。
[0006]在本专利技术中，若SEQ ID NO:1所示的二氢硫辛酰胺脱氢酶的氨基酸序列中 第45位、131位、167位氨基酸依次被替换为丝氨酸、甘氨酸和缬氨酸，则对应 的试虫为赤拟谷盗高抗性种群美国区系；若SEQ ID NO:1所示的二氢硫辛酰胺 脱氢酶的氨基酸序列中第45位、131位、167位氨基酸依次被替换为丝氨酸、丝 氨酸和缬氨酸，则对应的试虫为赤拟谷盗高抗性种群澳大利亚区系；若SEQ IDNO:1所示的二氢硫辛酰胺脱氢酶的氨基酸序列中第45位、131位、167位氨基 酸依次被替换为丝氨酸、天冬氨酸和丙氨酸，则对应的试虫为赤拟谷盗高抗性种 群巴西区系；若SEQ ID NO:1所示的二氢硫辛酰胺脱氢酶的氨基酸序列中第4 5位、131位、167位氨基酸依次被替换为丝氨酸、天冬氨酸和缬氨酸，则对应 的试虫为赤拟谷盗高抗性种群中国区系。
[0007]在本专利技术中，采用反转录PCR方法扩增待测高抗性赤拟谷盗的二氢硫辛酰胺 脱氢酶基因序列并测序，得到对应的氨基酸序列。
[0008]在本专利技术中，反转录PCR方法包括如下步骤：(1)合成cDNA第一链；(2) 以所述cDNA第一链为模板，PCR扩增二氢硫辛酰胺脱氢酶基因。
[0009]在本专利技术中，反转录PCR方法中的引物包括Tc
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F和Tc
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R；Tc
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F的序列为： CGGAAAAAAATGGGCAGC；Tc
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R的序列为：CACCGGGAGGTCATCATA。
[0010]本专利技术的有益效果在于：本专利技术确定的二氢硫辛酰胺脱氢酶(EC1.8.1.4)目 标位点氨基酸可以作为储粮害虫种群不同地理区系的判别，为区分储粮害虫高抗 性种群地理区系提供必要数据和方法，该方法简便、精准、高效。
[0011]图1赤拟谷盗的总RNA琼脂凝胶电泳图，其中A1、A2为美国采集试虫种群， A3、A4为澳大利亚采集试虫种群，A5、A6为巴西采集试虫种群，A7、A8为中 国采集试虫种群。
附图说明
[0012]图1赤拟谷盗的总RNA琼脂凝胶电泳图，其中A1、A2为美国采集试虫种 群，A3、A4为澳大利亚采集试虫种群，A5、A6为巴西采集试虫种群，A7、A8 为中国采集试虫种群。
具体实施方式
[0013]以下实施例用于进一步说明本专利技术，但是不应该理解为是对本专利技术的限制， 在不违背本专利技术实质和精神的前提下，任何对本专利技术所做的优化和替换，均属于 本专利技术范畴。若未特别声明，下列实施例种涉及的技术手段均为本科学领域技术人员普遍 使用的常规技术。
[0014]实施例1
[0015]一.试虫的种属鉴定和抗性检测
[0016]将收集到的来源于美国、澳大利亚、巴西和中国的52份试虫(表1)进行 种属鉴定和抗性检测。
[0017](1)种属鉴定
[0018]上述52份试虫按照GB/T 37719.1
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2019《粮油储藏储粮害虫检验辅助图谱 第1部分：拟步甲科》进行形态鉴定，确定为赤拟谷盗。
[0019](2)抗性测定
[0020]采用联合国粮食及农业组织(以下简称FAO)推荐的排水法装置 (Anonymous.Recommended Methods for the Detection and Measurement ofResistance of Agricultural Pests to Pesticides.Teantative Method for Adults of SomeMajor Pest Species of Stored Cereals,with Methyl Bromide and Phosphine[J].FAOPlant Protection Bulletin,1975,23:12
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25.)测定试虫抗性。PH3气体由磷化锌与10％ 的硫酸参与反应制得。采用FAO推荐的储粮害虫磷化氢抗性测定的方法。每个 熏蒸瓶挑选50头成虫，用高真空硅脂玻璃旋塞密封，浓度设置在有效浓度区间， 使用相应量程的气密性注射器抽取磷化氢气体，从橡胶塞中将气体注入瓶内，置 于(30
±
1)℃、RH 75％
±
5％、无光照的恒温恒湿培养箱中密闭熏蒸约20h。再 按照熏蒸瓶的容积与注入的磷化氢气体体积，计算出磷化氢的浓度。每个浓度设 置3个重复组，并注射相同体积的空气组成对照。待熏蒸时间结束，在通风橱中 将熏蒸瓶的玻璃旋塞打开，放置大约1h使气体充分散尽后将试虫从熏蒸瓶中取 出，并且将赤拟谷盗放入饲料充足的培养箱中观察14d，分别用毛笔轻触碰虫体 尾部，四肢不动的成虫视为死亡试虫，记录每组浓度试虫的死亡率，并根据抗性 计算公式计算赤拟谷盗抗性系数(王晶磊,王殿轩,肖雅斌,等.辽宁地区储粮害 虫对磷化氢抗性测定及对策研究[J].粮食与饲料工业,2014(9):16
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18+23.)。抗性 系数Rf介于50～160判定为高抗性种群。
[0021]结果见表1。可以看到，51份试虫为赤拟谷盗磷化氢高抗性种群，1份试虫 为赤拟谷盗磷化氢无抗性种群。
[0022]表1赤拟谷盗高抗性测定结果
[0023][0024][0025]二、对表1中52份试虫采用二氢硫辛酰胺脱氢酶(EC1.8.1.4)鉴定赤拟谷 盗高抗性种群地理区系
[0026]1、试虫总RNA提取
[0027]采用Trizol试剂提取法试剂盒(购自Vazyme，南京)，分别提取表1中52 份试虫的总RNA，具体操作步骤如下：
[0028](1)配制浓度为75％的乙醇水溶液作为备用，并用其擦拭移液枪和超净工作台， 以达到消毒效果；
[0029](2)将
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80℃冻存好的试虫本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种储粮害虫赤拟谷盗高抗性种群地理区系的鉴定方法，其特征在于，通过检测二氢硫辛酰胺脱氢酶的氨基酸或者核苷酸序列鉴定储粮害虫赤拟谷盗高抗性种群地理区系。2.根据权利要求1所述鉴定方法，其特征在于，若SEQ ID NO:1所示的二氢硫辛酰胺脱氢酶的氨基酸序列中第45位、131位、167位氨基酸依次被替换为丝氨酸、甘氨酸和缬氨酸，则对应的试虫为赤拟谷盗高抗性种群美国区系；若SEQ ID NO:1所示的二氢硫辛酰胺脱氢酶的氨基酸序列中第45位、131位、167位氨基酸依次被替换为丝氨酸、丝氨酸和缬氨酸，则对应的试虫为赤拟谷盗高抗性种群澳大利亚区系；若SEQ ID NO:1所示的二氢硫辛酰胺脱氢酶的氨基酸序列中第45位、131位、167位氨基酸依次被替换为丝氨酸、天冬氨酸和丙氨酸，则对应的试虫为赤拟谷盗高抗性种群巴西区系；若SEQ ID NO:1所示的二氢硫...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晟源，富瑶瑶，张鑫，肖雅予，马廷娇，姚堃，吴凡，沐雨欣，
申请(专利权)人：南京财经大学，
类型：发明
国别省市：