一种窄粒径分布琼脂糖凝胶微球的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种窄粒径分布琼脂糖凝胶微球的制备方法。该方法使用葡聚糖预改性琼脂糖，添加Na2HPO4、双功能乳化剂，调节试剂配比及乳化工艺，经固化、洗涤得到窄粒径分布的琼脂糖凝胶微球。本发明专利技术可制得粒径集中在50～160μm的琼脂糖凝胶微球。该制备方法的有益效果：与微膜乳化法及高压喷射法相比，工艺简单、对设备要求低、易于放大生产；反应条件温和、生产周期短；琼脂糖凝胶微球的粒径分布集中；可通过调控乳化时间得到不同粒径的凝胶微球，应用范围广。用范围广。用范围广。

【技术实现步骤摘要】
一种窄粒径分布琼脂糖凝胶微球的制备方法


[0001]本专利技术涉及生物医药下游分离纯化领域，具体涉及一种窄粒径分布琼脂糖凝胶微球的制备方法。

技术介绍

[0002]琼脂糖是一种由多个半乳糖交替连接形成的线性多糖，主要由1,3连结的β
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D
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半乳糖和1,4连结的3,6
‑
内醚
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L
‑
半乳糖交替连接构成。琼脂糖亲水性好，并且几乎不存在带电基团，对敏感的生物大分子极少引起变性，常作为层析介质用于生物医药的分离纯化。琼脂糖分子结构的糖链之间存在次级链(氢键)，因此在合适条件下可维持凝胶网状结构，并且琼脂糖凝胶微球具有五角形的大孔，可以容许大分子量的物质扩散，这也是其应用于生物大分子分离纯化的优势所在。
[0003]琼脂糖凝胶微球是一种多孔、亲水、不含带电基团、生物相容性好的天然多糖型生物层析填料。并且因为琼脂糖凝胶微球富含多羟基，可通过化学键合获得具有不同功能基团的衍生物微球，从而应用于不同类型的层析工艺。目前，琼脂糖凝胶微球主要用于分离纯化病毒、蛋白质、酶、多肽等大分子生物活性物质，在生物医药、血液制品、疫苗、化妆品及保健品等行业应用广泛。
[0004]目前，层析分离中主要应用的琼脂糖微球，如Sepharose系列，以及以此为基础偶联不同配基所制备的一系列疏水、亲和、离子交换层析微球等，其平均粒径均在90μm左右，粒径分布范围一般在45～165μm之间(林楠.常规膜乳化法制备大粒径琼脂糖微球.Diss.北京:北京化工大学,2009.)。近年来，研究人员对琼脂糖凝胶微球的制备做了不少工作。在公告号为CN108905977A的专利中报道了一种琼脂糖凝胶微球的制备方法，以琼脂糖固体为基质，经交联剂活化后与硫酸酐反应，得到硫酸酐琼脂糖，再将其制备成所述琼脂糖凝胶微球，所得的微球尺寸在10～1000μm。在公告号为CN111073061A的专利中公开了一种通过两相成球法制备的琼脂糖凝胶微球，其粒径集中在20～300μm。此外，在公告号为CN1304101C的专利中公开了一种膜乳化法结合机械搅拌法制备的琼脂糖凝胶微球，得到的微球尺寸在1～100μm，其工艺流程较长，对设备要求较高。
[0005]在琼脂糖凝胶微球实际制备过程中，由于小乳滴易被大乳滴吸收，而大乳滴又在剪切力的作用下产生小乳滴，因而所制备的琼脂糖凝胶微球常出现粒径分布不均、粒径分布范围过大等问题。
[0006]总的来说，制备粒径在45～165μm之间(层析分离中主要应用的琼脂糖微球的粒径范围)、窄粒径分布的琼脂糖凝胶微球依旧是目前研究的难点。因此，开发窄粒径分布并且工艺简单的琼脂糖凝胶微球的制备工艺，对促进我国生物医药产业，特别是下游层析分离纯化领域的健康发展具有重要意义。

技术实现思路

[0007]针对琼脂糖凝胶微球制备过程中常出现的粒径分布过宽，以及获得粒径均一琼脂
糖凝胶微球工艺流程较长、设备要求较高等问题，本专利技术提供了一种窄粒径分布琼脂糖凝胶微球的制备方法，制备得的琼脂糖凝胶微球中粒径范围在50～160μm内的微球占比不低于85％。
[0008]本专利技术的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种合成简便，窄粒径分布，易于规模放大生产的琼脂糖凝胶微球的制备方法。
[0009]本专利技术实现上述目的采用的技术方案是：
[0010]一种窄粒径分布琼脂糖凝胶微球的制备方法，包括以下步骤：
[0011](1)将琼脂糖加入至去离子水中，搅拌并加热至琼脂糖完全溶解，待澄清溶胶形成后，持续搅拌下，加入葡聚糖和Na2HPO4，继续搅拌5～30min，搅拌速率为100～200rpm，得到A液；
[0012]所述琼脂糖、所述去离子水、所述葡聚糖、所述Na2HPO4的比例为0.2～3g:20mL:0.001～0.1g:0.1～1g；
[0013]所述葡聚糖以水溶液形式加入，葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为0.1～5％；
[0014]所述Na2HPO4以水溶液形式加入，Na2HPO4水溶液中Na2HPO4的质量浓度为0.05～0.5g mL
‑1；
[0015](2)将乳化剂加入到油相中并加热至60～120℃，持续搅拌20～30min，搅拌速率为250～350rpm，得到B液；
[0016]所述乳化剂为Span80和Tween80的组合，其中Span80和Tween80的质量比为1～10:1；
[0017]所述油相和所述去离子水的体积比为10～100:20；
[0018]所述B液中，乳化剂的质量浓度为1～10％；
[0019](3)将步骤(1)所得的A液加入到步骤(2)所得的B液中，持续搅拌，搅拌速率为100～200rpm，乳化一定时间，得到相应产物；
[0020](4)将步骤(3)所得的产物降温固化，静置分层后，移去上层油层，使用洗涤剂除去下层产物中的油相，得到所述窄粒径分布琼脂糖凝胶微球。
[0021]优选地，在步骤(1)中，所述琼脂糖、所述去离子水、所述葡聚糖、所述Na2HPO4的比例为0.6～2g:20mL:0.001～0.02g:0.1～0.5g。
[0022]优选地，在步骤(2)中，所述油相为甲苯、正辛烷、液体石蜡、正庚烷中的一种或几种，进一步优选为甲苯。
[0023]优选地，在步骤(2)中，所述油相和所述去离子水的体积比为60～80:20。
[0024]优选地，在步骤(2)中，所述B液中，乳化剂的质量浓度为2～5％。
[0025]优选地，在步骤(2)中，所述乳化剂中Span80和Tween80的质量比为2～6:1。
[0026]优选地，在步骤(3)中，所述乳化的时间为10～60min。
[0027]优选地，在步骤(3)中，在所述乳化的过程中，即时取样至光学显微镜下观察，获得预期凝胶微球尺寸后，停止乳化。
[0028]优选地，在步骤(4)中：
[0029]所述洗涤剂为乙醇、水、丙酮、正己烷中的一种或几种；进一步优选为乙醇和水的组合，其中乙醇的体积分数为10％。
[0030]本专利技术采用改进的两相成球法制备琼脂糖凝胶微球，为了有效调控琼脂糖凝胶微球的粒径分布，本专利技术的改进之处在于：
[0031](a)使用葡聚糖溶液预改性琼脂糖溶胶，通过葡聚糖分子与琼脂糖分子的交叉互联有效减少琼脂糖分子间的相互碰撞，有效避免琼脂糖分子间的过度交联；
[0032](b)使用Na2HPO4有效改善琼脂糖
‑
葡聚糖混合溶液的离子环境，促进两分子的交联进程；
[0033](c)在乳化工艺中，选用质量比为1～10：1的Span80和Tween80作为乳化剂，该乳化剂组合为双功能乳化剂，其中Span80的亲水亲油平衡值为4.3，Tween80的亲水亲油平衡值为15.0，在该质量比条件下，得到的乳状液的稳定性好，并通过设置搅拌速率为100～200rpm，有效避免了大乳滴在搅拌过程本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种窄粒径分布琼脂糖凝胶微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将琼脂糖加入至去离子水中，搅拌并加热至琼脂糖完全溶解，待澄清溶胶形成后，持续搅拌下，加入葡聚糖和Na2HPO4，继续搅拌5～30min，搅拌速率为100～200rpm，得到A液；所述琼脂糖、所述去离子水、所述葡聚糖、所述Na2HPO4的比例为0.2～3g:20mL:0.001～0.1g:0.1～1g；所述葡聚糖以水溶液形式加入，葡聚糖水溶液中葡聚糖的质量百分比为0.1～5％；所述Na2HPO4以水溶液形式加入，Na2HPO4水溶液中Na2HPO4的质量浓度为0.05～0.5g mL
‑1；(2)将乳化剂加入到油相中并加热至60～120℃，持续搅拌20～30min，搅拌速率为250～350rpm，得到B液；所述乳化剂为Span80和Tween80的组合，其中Span80和Tween80的质量比为1～10:1；所述油相和所述去离子水的体积比为10～100:20；所述B液中，乳化剂的质量浓度为1～10％；(3)将步骤(1)所得的A液加入到步骤(2)所得的B液中，持续搅拌，搅拌速率为100～200rpm，乳化一定时间，得到相应产物；(4)将步骤(3)所得的产物降温固化，静置分层后，移去上层...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐偲，王晓钟，戴立言，陈英奇，
申请(专利权)人：浙江大学衢州研究院，
类型：发明
国别省市：