一种新的基于NanoSPR技术的生物传感芯片的检测方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种新的基于NanoSPR技术的生物传感芯片的检测方法及应用，属于体外定性定量检测技术领域。本发明专利技术提供的生物传感芯片包括基片和修饰在基片上的蛋白、抗体或功能基团；基片从下至上依次包括基底、钛膜、银膜和金膜，基底表面矩阵排列有纳米孔；钛膜的厚度为2

【技术实现步骤摘要】
一种新的基于NanoSPR技术的生物传感芯片的检测方法及应用


[0001]本专利技术属于人/动物体内抗体定性定量检测
，特别是基于纯NanoSPR技术的快速检测人/动物体内抗体的方法。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(ASF)是一种传染性极强的病毒性疾病，影响家猪和野猪，死亡率高，传播迅速，造成巨大的社会经济损失。其病原是一种大而有包膜的DNA病毒，即ASF病毒(ASFV)。目前，还没有批准的疫苗或针对ASFV的有效治疗方法。因此，疾病控制主要依靠早期诊断，及时扑杀感染猪，提高生猪行业的生物安全控制。感染ASFV，尤其是亚急性感染后，存活的猪可能会检测到ASFV抗体水平。因此，它是在受ASF影响的地方性流行地区检测ASFV抗体的良好标志物。抗体检测经济，与自动化设备兼容，适用于高通量筛选。由于目前还没有商业疫苗可用，因此在这种情况下，抗体仍然是ASFV感染的明确指标。因此，开发一种用于ASFV监测的快速抗体检测方法在该领域具有重要意义。
[0003]纳米等离子芯片技术(NanoSPR)不同于等离子芯片技术(SPR)和局部表面等离子体共振技术(LSPR)两种技术模式，由于其独特的三维结构，不同于平面模型的SPR效应，也不同于金属纳米颗粒的LSPR效应，可以同时支持SPR与LSPR两种模式。
[0004]纳米孔阵列生物传感器的等离子共振效应可以直接入射到纳米孔金属结构，表面光场立即激发，因此不需要复杂的光路和大型光学仪器的支持。NanoSPR技术既保留了传统SPR传感器的实时、无需标记、无背景干扰、高分辨率等诸多优点，又保留了LSPR传感器在性能改造上的优势；通过对纳米孔阵列的孔径、深度、形状、周期以及表面金属的类型、厚度等参数的调节，选择出可以捕捉到存在LSPR最强信号的高品质芯片，无需大型光谱仪也可以得到更强的信号。
[0005]目前，基于金纳米颗粒、乳胶微球或荧光染料微球的侧向流动免疫层析条被设计用于现场检测血清中的ASFV抗体。而其灵敏度和稳定性定量仍有待进一步提高，而且无法准确量化ASFV的抗体含量。基于TaqMan的实时定量PCR(RT
‑
PCR)和ELISA是欧盟参考实验室和OIE中使用最广泛的基于实验室免疫学的诊断方法，因为它们具有高灵敏度。遗憾的是，上述方法不能广泛应用于养猪场的快速检测领域。近年来，一些先进的技术，如等温扩增、侧流色谱和微流控芯片，已被用于检测ASFV。但诊断技术产品都不能满足早期、灵敏、定量现场诊断的需求。
[0006]所以我们开发了一种新的基于NanoSPR技术的生物传感芯片检测ASFV非洲猪瘟抗体。

技术实现思路

[0007]为了满足上述非洲猪瘟ASFV抗体诊断技术的要求，本专利技术提供了一种基于纯NanoSPR技术的生物传感芯片，用于超灵敏定量检测血清中的ASFV抗体。具有较高的检测灵
敏度，采用该生物传感芯片检测非洲猪瘟抗体等其他抗体具有高通量、耗时短，检测结果准确，即时检测(POCT)的潜力等优点，无需标记，通过二抗夹心法直接放大待测物抗体，可用于高通量定量或筛选质控。具体通过以下技术实现。
[0008]基于NanoSPR技术的生物传感芯片，包括基片和修饰在所述基片上的蛋白、抗体或功能基团；所述基片从下至上依次包括基底、钛膜、银膜和/或金膜，所述基底表面压印矩阵排列的纳米孔；所述纳米孔直径为50
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800nm，高度为100
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800nm，相邻两个所述纳米孔的间距为200
‑
1000nm；所述钛膜的厚度为2
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20nm，所述银膜的厚度为8
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80nm，所述金膜的厚度为5
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50nm；所述蛋白、抗体或功能基团具体是指与病毒抗体特异性结合的蛋白、抗体、适配体或功能基团。例如可以结合非洲猪瘟病毒抗体的P30蛋白、P54蛋白；可以结合非洲猪瘟病毒抗体的羊抗猪
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IgG(北京博奥龙)、Protein A(义翘神舟)、羊抗猪
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IgG(安提)、兔抗猪
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IgG(博尔西)。
[0009]优选地，所述钛膜的厚度为10nm，所述银膜的厚度为80nm，所述金膜的厚度为15nm。
[0010]本专利技术还提供了上述基于NanoSPR技术的生物传感芯片的修饰制备方法，包括以下步骤：
[0011]S1、清洗所述基片，滴加5
‑
50μg/ml P30蛋白和/或P54蛋白溶液1
‑
50μl；4
‑
37℃孵育1.5
‑
24h，再用PBST溶液多次清洗已包被P30蛋白和/或P54蛋白的基片；
[0012]S2、在步骤S1所得基片表面滴加封闭液，25
‑
37℃孵育1
‑
4h，去除多余封闭液；
[0013]S3、在步骤S2所得基片表面滴加保护液，25
‑
37℃孵育0.5
‑
1h，去除多余保护液，干燥后制得生物传感芯片。
[0014]所述封闭液是将牛血清白蛋白溶解于CBS溶液中配制而成的浓度10μg/ml的复合液；所述CBS溶液中含有碳酸钾4
‑
6g/L、碳酸氢钠7.5
‑
10g/L、防腐剂Proclin300 2.5
‑
5ml/L；
[0015]所述保护液是将糖类溶解于PBST溶液中配制而成的浓度10
‑
200μg/ml的复合液；所述糖类为葡聚糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖中的一种；
[0016]优选地，所述PBST溶液中含有十二水磷酸氢二钠2
‑
3g/L、磷酸二氢钠0.2
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0.5g/L、氯化钾0.1
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0.3g/L、氯化钠6
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8g/L、Tween
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20 0.5
‑
1ml/L、防腐剂Proclin300 0.5
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1ml/L。
[0017]本专利技术还提供了一种芯片微孔板，该芯片微孔板集成了上述生物传感芯片。该芯片微孔板可以选用1孔
…
48孔、96孔等各种不同种类的微孔板。
[0018]本专利技术还提供了一种基因递送载体的检测试剂盒，该试剂盒包括上述生物传感芯片，或者包括上述芯片微孔板。该试剂盒可以基于不同的检测方法(无标记检测、夹心法)，配备其他不同的试剂。
[0019]优选地，上述检测试剂盒还包括洗涤液、抗体纯化参考品、非洲猪瘟血清样品。羊抗猪IgG抗体、P30蛋白和/或P54蛋白分别能在非洲猪瘟抗体的不同表位与之结合。
[0020]利用上述芯片微孔板或检测试剂盒检测待测样品中的基因递送载体浓度的一种使用方法，该方法不需要使用胶体金等发光试剂，而是直接将芯片微孔板插入全光谱酶标仪中进行检测，对抗体检测具有非常好的灵敏度和特异性，具体方法为：
[0021]P1、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于纯NanoSPR技术的生物传感芯片，其特征在于，包括基片和修饰在所述基片上的蛋白、抗体或功能基团；所述基片从下至上依次包括基底、钛膜、银膜和/或金膜，所述基底表面压印矩阵排列的纳米孔；所述纳米孔直径为50
‑
800nm，高度为100
‑
800nm，相邻两个所述纳米孔的间距为200
‑
1000nm；所述钛膜的厚度为2
‑
20nm，所述银膜的厚度为9
‑
90nm，所述金膜的厚度为5
‑
50nm；所述蛋白、抗体或功能基团具体是指与待测物抗体特异性结合的蛋白、抗体、适配体或功能基团。2.根据权利要求1所述的基于纯NanoSPR技术的生物传感芯片，其特征在于，所述钛膜的厚度为10nm，所述银膜的厚度为80nm，所述金膜的厚度为15nm。3.权利要求1或2所述的基于纯NanoSPR技术的生物传感芯片的修饰制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、清洗所述基片，滴加5
‑
50μg/ml P30蛋白和/或P54蛋白溶液1
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50μl；4
‑
37℃孵育1.5
‑
24h，再用PBST溶液多次清洗已包被P30蛋白和/或P54蛋白的基片；S2、在步骤S1所得基片表面滴加封闭液，25
‑
37℃孵育1
‑
4h，去除多余封闭液；S3、在步骤S2所得基片表面滴加保护液，25
‑
37℃孵育0.5
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1h，去除多余保护液，干燥后制得生物传感芯片。4.根据权利要求3所述的基于纯NanoSPR技术的生物传感芯片的修饰制备方法，其特征在于，所述封闭液是将牛血清白蛋白溶解于CBS溶液中配制而成的浓度10μg/ml的复合液；所述CBS溶液中含有碳酸钾4
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6g/L、碳酸氢钠7.5
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10g/L、防腐剂Proclin300 2.5
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5ml/L。5.根据权利要求3所述的基于纯NanoSPR技术的生物传感芯片的修饰制备方法，其特征在于，所述保护液是将糖类溶解于PBST溶液中配制而成的浓度10
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200μg/ml的复合液；所述糖类为葡聚糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖中的一种。6.根据权利要求3所述的基于纯NanoSPR技术的生物传感芯片的修饰制备方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄丽萍，刘钢，李睿，周翰霖，樊洪利，
申请(专利权)人：量准上海医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：