包含人IV型胶原7S结构域的片段的测定方法以及用于该测定方法的试剂盒技术

本发明专利技术提供一种测定方法，其使用能够与人IV型胶原7S结构域特异性结合的第一单克隆抗体固定在载体上而形成的捕获抗体和能够与人IV型胶原7S结构域特异性结合的第二单克隆抗体结合于标记物质而形成的标记抗体，通过夹心免疫测定来测定试样中的包含人IV型胶原7S结构域的片段。构域的片段。构域的片段。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含人IV型胶原7S结构域的片段的测定方法以及用于该测定方法的试剂盒


[0001]本专利技术涉及试样中的包含人IV型胶原7S结构域的片段的测定方法以及用于该测定方法的试剂盒。

技术介绍

[0002]IV型胶原是与层粘连蛋白(Laminin)一同构成基底膜的主要蛋白质，以具有由3条α链构成的螺旋结构的三聚体作为结构单元。虽然根据组织而构成所述三聚体的亚单位不同，但在以肝脏为例的许多组织中，所述三聚体由两条α1链和一条α2链构成。IV型胶原分子在形成所述螺旋结构的TH结构域(Triple Helical collagenous domain)的两端具有IV型胶原分子特有的结构，将N末端的结构称为7S结构域，将C末端的结构称为NC1结构域(Noncollagenous domain)。C末端的NC1结构域与其它IV型胶原分子的NC1结构域形成二聚体，另外，N末端的7S结构域与其它IV型胶原分子的7S结构域形成四聚体。这些多聚体均通过共价键分别牢固地结合，通过这些的聚合，IV型胶原分子形成网眼结构(Chicken
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wire network)。
[0003]众所周知，人的肝脏中，基于乙型、丙型的病毒性慢性肝炎或酒精性慢性肝炎的长期化、进行性的非酒精性脂肪性肝炎(non
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alcoholic steatohepatitis：NASH)等，肝纤维化逐渐进行而发展为肝硬化或肝癌，而此时IV型胶原增加。由于IV型胶原伴随着这样的肝纤维化的进行而从基底膜漏出到血中的量增加，因此来源于IV型胶原分子的成分的血中浓度成为肝纤维化进行的指标。特别是，认为通过共价键牢固地结合的7S结构域不易受到蛋白水解酶的影响并在血液中也稳定，从而作为用于肝纤维化的进展度(重症度)或肝硬化的诊断的生物标记使用。
[0004]但是，作为诊断剂得到批准的这样的7S结构域的测定试剂，只有作为使用了放射性免疫测定(RIA)的诊断剂的“IV型胶原
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7S试剂盒(DENIS Pharma株式会社制造)”。IV型胶原
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7S试剂盒是使用抗人IV型胶原兔多克隆抗体的试剂。
[0005]另外，在日本特开平2
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1553号公报(专利文献1)中记载了如下方法：将与胃蛋白酶可溶化人IV型胶原7S结构域进行交叉反应的单克隆抗体作为酶标记抗体，使仅与人IV型胶原7S结构域反应的单克隆抗体与固相载体结合而作为抗体结合固相载体(捕获抗体)，通过一步法夹心免疫测定对人IV型胶原7S结构域进行定量。现有技术文献专利文献
[0006]专利文献1：日本特开平2
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1553号公报

技术实现思路

专利技术要解决的技术问题
[0007]但是，在所述IV型胶原
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7S试剂盒中，使用针对人IV型胶原的多克隆抗体，并且由
于是以结合竞争抑制为原理，因此测定精度还不充分。特别是，本专利技术人等发现了如下技术问题：来源于健康人的样本的测定值变高，假阳性率变高，不适于肝纤维化的初期阶段的患者的筛选或鉴别。
[0008]另外，在来源于发生了肝纤维化的患者(肝硬化患者、NASH患者等)的血中，作为包含7S结构域的IV型胶原片段，存在小～大分子各种形态的胶原片段，而本专利技术人们发现：所述IV型胶原
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7S试剂盒、或将与胃蛋白酶可溶化人IV型胶原7S结构域进行交叉反应的单克隆抗体用作酶标记抗体的专利文献1中记载的方法并不能充分检测小分子化的胶原片段，因此难以全部网罗这些胶原片段来进行测定，由此，存在测定精度有时根据样本而降低的技术问题。
[0009]进而，本专利技术人发现：在这些以往的方法中，由于容易受到试样中包含的IV型胶原的7S结构域以外的部位或其它成分的影响，所以也存在测定精度容易降低的技术问题。
[0010]本专利技术是鉴于上述本专利技术人等新发现的技术问题而完成的，其目的在于提供一种测定方法以及用于其的试剂盒，其不会使针对来源于患者的试样(阳性样本)的特异性降低，能够使针对来源于健康人的试样(阴性样本)的非特异性降低，并且能够高精度地测定试样中的包含人IV型胶原7S结构域的片段。用于解决技术问题的技术方案
[0011]为了解决上述技术问题进行了潜心研究，结果本专利技术人们发现：通过组合了能够对人IV型胶原7S结构域进行部位特异性结合的单克隆抗体的夹心免疫测定，其不会使来源于患者的试样(阳性样本)的测定值降低，能够充分降低来源于健康人的试样(阴性样本)的测定值，特别是在包含人IV型胶原7S结构域的片段的低浓度区域中，能够实现比以往高的测定精度。另外，根据该方法，作为包含7S结构域的IV型胶原片段，无论哪种形态的胶原片段均能够网罗性地测定，进一步地，也不易受到试样中存在的物质或IV型胶原的7S结构域以外的部位的影响，由此能够实现比以往更高的测定精度，从而完成了本专利技术。
[0012]由该见解得到的本专利技术的方式如下。[1]一种测定方法，使用能够与人IV型胶原7S结构域特异性结合的第一单克隆抗体固定在载体上而形成的捕获抗体和能够与人IV型胶原7S结构域特异性结合的第二单克隆抗体结合于标记物质而形成的标记抗体，通过夹心免疫测定来测定试样中的包含人IV型胶原7S结构域的片段。[2]根据[1]所述的测定方法，其包含：捕获工序，所述捕获工序使所述试样与所述捕获抗体接触，用所述捕获抗体捕获所述包含人IV型胶原7S结构域的片段；以及标记工序，所述标记工序在所述捕获工序之后，使所述标记抗体与被所述捕获抗体捕获的包含人IV型胶原7S结构域的片段接触，标记被所述捕获抗体捕获的包含人IV型胶原7S结构域的片段。[3]根据[1]或[2]所述的测定方法，其中，所述包含人IV型胶原7S结构域的片段与第一单克隆抗体的反应体系的盐浓度为0.35M以上。
[4]一种试剂盒，其用于[1]～[3]中任一项所述的测定方法，所述试剂盒包含：能够与人IV型胶原7S结构域特异性结合的第一单克隆抗体；能够与第一单克隆抗体结合的载体；能够与人IV型胶原7S结构域特异性结合的第二单克隆抗体；以及能够与第二单克隆抗体结合的标记物质。[5]根据[4]所述的试剂盒，其包含：第一单克隆抗体固定在所述载体上而形成的捕获抗体；以及第二单克隆抗体结合于所述标记物质而形成的标记抗体。专利技术效果
[0013]根据本专利技术，能够提供一种测定方法以及用于其的试剂盒，其不会使针对来源于患者的试样(阳性样本)的特异性降低，能够使针对来源于健康人的试样(阴性样本)的非特异性降低，并且能够高精度地测定试样中的包含人IV型胶原7S结构域的片段。
附图说明
[0014]图1是表示实施例1(1)的胶原酶处理中的SDS
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PAGE的结果的电泳照片。图2是表示将IV型胶原7S片段作为抗原时的各单克隆抗体的浓度与吸光度的关系的图表。图3是表示将胃蛋白酶可溶化IV型胶原片段作为抗原时的各单克隆抗体的浓度与吸光度的关系的图表。图4是表示标准溶液中的IV型胶原7S片段的浓度与发光量的关系的图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种测定方法，其使用：能够与人IV型胶原7S结构域特异性结合的第一单克隆抗体固定在载体上而形成的捕获抗体；和能够与人IV型胶原7S结构域特异性结合的第二单克隆抗体结合于标记物质而形成的标记抗体，通过夹心免疫测定来测定试样中的包含人IV型胶原7S结构域的片段。2.根据权利要求1所述的测定方法，其中，所述测定方法包含：捕获工序，其中，使所述试样与所述捕获抗体接触，用所述捕获抗体捕获所述包含人IV型胶原7S结构域的片段；以及标记工序，其中，在所述捕获工序之后，使所述标记抗体与被所述捕获抗体捕获到的包含人IV型胶原7S结构域的片段接触，标记被所述捕获抗体捕获到的包含人IV型胶原...

【专利技术属性】
技术研发人员：片桐典子，八木慎太郎，青柳克己，
申请(专利权)人：富士瑞必欧株式会社，
类型：发明
国别省市：