一种耐高温植物乳杆菌的驯化方法及植物乳杆菌粉剂的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种耐高温植物乳杆菌的驯化方法及植物乳杆菌粉剂的制备方法。本发明专利技术通过对植物乳杆菌进行驯化，可以促进驯化后的植物乳杆菌的耐热能力得以提升，使得喷雾干燥后的存活率得到明显提升。同时该方法不影响其菌量。本发明专利技术提供的驯化方法简单易行，菌株不易退化，适合于大部分工厂进行生产，对植物乳杆菌的大规模生产应用具有较大的推动作用。菌的大规模生产应用具有较大的推动作用。菌的大规模生产应用具有较大的推动作用。

【技术实现步骤摘要】
一种耐高温植物乳杆菌的驯化方法及植物乳杆菌粉剂的制备方法


[0001]本专利技术涉及益生菌培养
，具体而言，涉及一种耐高温植物乳杆菌的驯化方法及植物乳杆菌粉剂的制备方法。

技术介绍

[0002]植物乳杆菌是乳酸菌的一种，是一类不能形成芽孢、能产乳酸的革兰氏阳性菌。厌氧或兼性厌氧，菌体呈直或弯的杆状，单个、有时成对或或成链状。其繁殖能力强，单位活菌量高，且能大量产酸，既能起到维持肠道菌群、抑制致病菌的作用，还能起到抗氧化、抗肿瘤等的作用。
[0003]然而，植物乳杆菌虽然繁殖能力、产酸能力优秀，但其不仅没有芽孢杆菌的高抗逆性，甚至其作为乳酸杆菌，相比较粪肠球菌等乳酸球菌，其耐热、耐酸等的能力较差。目前，针对此类耐酸、耐热能力差的菌种，一般通过包被的方式来提高其抗逆性。
[0004]现有的包被的方式包括：提前挤压固化、通过化学方法提前形成微囊、喷雾干燥等。其中，提前挤压固化、通过化学方法方法法提前形成微囊存在效率低、设备限制多等缺点。而目前最便捷的方式还是通过喷雾干燥来直接形成微胶囊粉剂。而植物乳杆菌由于其耐热能力差，而喷雾干燥温度较高会导致存活率很难提升，喷雾干燥温度低则喷雾效果会受到很大的影响，因此如何提升植物乳杆菌在合理的喷雾干燥温度下的存活率尤为重要。
[0005]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种耐高温植物乳杆菌的驯化方法及植物乳杆菌粉剂的制备方法，从而提升植物乳杆菌在合理的喷雾干燥温度下的存活率。
[0007]本专利技术是这样实现的：
[0008]本专利技术提供了一种耐高温植物乳杆菌的驯化方法，其包括如下步骤：
[0009]第一阶段驯化：将待驯化的植物乳杆菌接种于培养基中在 36
‑
38℃培养23
‑
25h；然后将培养后的菌液与保护剂混合，置于 59
‑
61℃下水浴，计算水浴后的植物乳杆菌的存活率；接种水浴后的菌液至新的含培养基的培养容器中；重复第一阶段驯化至少2次，直至存活率≥90％，结束第一阶段驯化；
[0010]第二阶段驯化：将第一阶段驯化完成的菌液接种于含培养基的新的培养容器中，于36～38℃，培养23
‑
25h；然后将保护剂与培养后的菌液进行混合，于64
‑
66℃下水浴，计算水浴后的植物乳杆菌的存活率；接种水浴后的菌液至含培养基的新的培养容器中；重复第二阶段驯化至少3次，直至存活率≥85％，结束第二阶段驯化；
[0011]第三阶段驯化：将第二阶段驯化完成的菌液接种于含培养基的新的培养容器中，于36～38℃，培养23
‑
25h；然后将保护剂与培养后的菌液进行混合，于69
‑
71℃下水浴，计算水浴后的植物乳杆菌的存活率；接种水浴后的菌液至含培养基的新的培养容器中；重复第
三阶段驯化至少4次，直至存活率≥80％，结束第三阶段驯化；
[0012]在菌液中，保护剂包括如下重量百分比计的原料：海藻酸钠 1.5
‑
2％、氯化钙1
‑
1.2％、壳聚糖1.5
‑
2％、酵母细胞壁2.5％
‑
3％、葡萄糖酸
‑
δ
‑
内酯0.2
‑
0.4％、脱脂奶粉3
‑
4％和硬脂酸钠1
‑
1.2％；
[0013]存活率＝(水浴后菌量/水浴前菌量)*100％。
[0014]专利技术人发现，通过对植物乳杆菌进行驯化，可以促进驯化后的植物乳杆菌的耐热能力得以提升，使得喷雾干燥后的存活率得到明显提升。
[0015]若直接提高培养温度的方式进行菌株驯化，又存在培养温度一般无法超过55℃的问题，而实际喷雾干燥时的出风温度大约为70℃，在相差较大的温度下，仍然无法有效提升喷雾干燥时的植物乳杆菌的存活率。专利技术人采用梯度升温，在第三阶段采用70℃左右的温度水浴的方式来模拟喷雾干燥过程，更接近实际生产时的条件，使得喷雾干燥后的存活率得到明显提升，同时还维持了菌株的遗传稳定性。
[0016]专利技术人出于如下两个方面的缘由采用梯度升温的方式进行菌株的驯化：一方面植物乳杆菌耐热能力极差，直接采用70℃水浴可能会在驯化过程中出现菌体完全死亡的情况导致驯化失败，另一方面直接采用70℃的水浴造成的高致死率极有可能导致菌株发生较大的突变，降低其遗传的稳定性。
[0017]起始(第一阶段驯化)水浴温度设置为59
‑
61℃是因为温度设置太低基本不会有植物乳杆菌死亡，太高的水浴温度容易导致菌株全部死亡。第三阶段驯化时的水浴温度69
‑
71℃则是根据喷雾干燥的常规温度设置的。
[0018]专利技术人之所以设置3个阶段的驯化，是因为每个阶段中间的温度差保持5℃具有较高的驯化效果，温差太小失去驯化的意义，温差太高一样可能会导致菌死亡。
[0019]专利技术人通过在水浴前，将菌液与保护剂混合，一方面，可以更真实的模拟实际喷雾干燥过程，针对性的对菌体与保护剂混合后的耐热能力进行驯化；另一方面某些保护剂虽然能起到在喷雾干燥中保护菌体的作用，但保护剂本身对菌体有一定的危害，通过与保护剂混合再水浴来进行驯化，也能筛选出耐受保护剂中有害成分的菌株。从而进一步提升菌株的存活率。
[0020]专利技术人还发现，在不同阶段设置一定的重复次数，有助于提升存活率。因而，在不同的阶段均设置有最低的重复次数，且均当存活率达到一定值才结束当前阶段，一方面是防止实际驯化过程中的偶然情况，另一方面如果驯化重复次数过低，或者存活率未达标即结束驯化，极有可能导致驯化不完全，驯化后的菌体还保留着耐热能力差、基因不稳定的菌株，导致后续扩培时大量耐热能力差的菌株扩培，进而导致喷雾干燥后植物乳杆菌的存活率低下。设置第一阶段的重复次数至少为2次，例如2
‑
10次，例如重复2次，3次，4次或5次。设置第二阶段的重复次数至少为3次，例如3
‑
10次，例如重复3次、4次、 5次、6次或7次。设置第三阶段的重复次数至少为4次，例如4
‑
10 次，例如重复4次、5次、6次、7次或8次。
[0021]此外，专利技术人还对保护剂成分进行了改进，其中，海藻酸钠与氯化钙作为微胶囊结构的主要包材，海藻酸钠结构中有着聚古洛糖醛酸链段，其与钙离子接触后，会发生凝胶化反应，形成聚合完全的网状结构，以此构成微胶囊的硬质外壳。
[0022]而脱脂奶粉中的酪蛋白则是作为形成微胶囊结构的主要成分，在葡萄糖酸
‑
δ
‑
内酯的作用下，蛋白质间发生交联，导致脱脂奶粉中的蛋白质凝固，成为微胶囊的结构骨架，
另外，葡萄糖酸
‑
δ
‑
内酯能有效降低pH，提供酸性环境，而海藻酸钙的硬质外壳在低pH的情况下结构更为稳定。
[0023]同时，在酸性环境下，壳聚糖分子链本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种耐高温植物乳杆菌的驯化方法，其特征在于，其包括如下步骤：第一阶段驯化：将待驯化的植物乳杆菌接种于培养基中在36
‑
38℃培养23
‑
25h；然后将培养后的菌液与保护剂混合，置于59
‑
61℃下水浴，计算水浴后的植物乳杆菌的存活率；接种水浴后的菌液至新的含培养基的培养容器中；重复第一阶段驯化至少2次，直至存活率≥90％，结束第一阶段驯化；第二阶段驯化：将第一阶段驯化完成的菌液接种于含培养基的新的培养容器中，于36～38℃，培养23
‑
25h；然后将保护剂与培养后的菌液进行混合，于64
‑
66℃下水浴，计算水浴后的植物乳杆菌的存活率；接种水浴后的菌液至含培养基的新的培养容器中；重复第二阶段驯化至少3次，直至存活率≥85％，结束第二阶段驯化；第三阶段驯化：将第二阶段驯化完成的菌液接种于含培养基的新的培养容器中，于36～38℃，培养23
‑
25h；然后将保护剂与培养后的菌液进行混合，于69
‑
71℃下水浴，计算水浴后的植物乳杆菌的存活率；接种水浴后的菌液至含培养基的新的培养容器中；重复第三阶段驯化至少4次，直至存活率≥80％，结束第三阶段驯化；在所述菌液中，所述保护剂包括如下重量百分比计的原料：海藻酸钠1.5
‑
2％、氯化钙1
‑
1.2％、壳聚糖1.5
‑
2％、酵母细胞壁2.5％
‑
3％、葡萄糖酸
‑
δ
‑
内酯0.2
‑
0.4％、脱脂奶粉3
‑
4％和硬脂酸钠1
‑
1.2％；存活率＝(水浴后菌量/水浴前菌量)*100％。2.根据权利要求1所述的耐高温植物乳杆菌的驯化方法，其特征在于，第一阶段中水浴的时间为10
‑
12min；第二阶段中水浴的时间为10
‑
12min；第三阶段中水浴的时间为10
‑
12min；优选地，重复第一阶段驯化至少3次，重复第二阶段驯化至少4次，重复第三阶段驯化至少6次。3.根据权利要求1所述的耐高温植物乳杆菌的驯化方法，其特征在于，所述第一阶段驯化前还包括对待驯化的菌株进行驯化前的复壮，所述复壮包括将植物乳杆菌接种到培养基中，在36～38℃，静置培养23～25h；然后将复壮后的植物乳杆菌用于所述第一阶段驯化...

【专利技术属性】
技术研发人员：张志榕，王小芬，郑甜力，田雷，覃智斌，蔡冬，张敬学，吴有林，
申请(专利权)人：金华傲农生物科技有限公司福建傲农生物科技集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：