一种虾肠道细胞提取和培养的方法技术

本发明专利技术属于虾肠道细胞培养的技术领域，具体涉及一种虾肠道细胞提取和培养的方法。首先将对虾置于含四抗液的煮沸的2

【技术实现步骤摘要】
一种虾肠道细胞提取和培养的方法


[0001]本专利技术属于虾肠道细胞培养的
，具体涉及一种虾肠道细胞提取和培养的方法。

技术介绍

[0002]我国是对虾养殖大国，也是对虾需求量巨大的国家。但是虾病毒的频繁爆发对对虾的养殖带来了严重的打击。特别是虾肠道疾病最近几十年来一直都只能用抗生素去治疗，但是结果都是微乎其微，导致对虾养殖业可持续发展遇到了瓶颈。对虾的肠道细胞的培养可以为虾的肠道疾病提供科学的研究方法，但是虾肠道里有很多的内容物和各种菌群，给虾肠道细胞培养造成很大的困难。虽然国内外很多专家学者在对虾肠道细胞分离和培养方面进行了大量的探索和努力，但目前还没有较大的进展。
[0003]目前，有关对虾肠道样本提取和培养的技术鲜有报道。专利CN201910622127.X公开了一种对虾的外周血淋巴细胞的提取和3D培养的永生技术，虽然说此方法可以适用于其他的虾的器官，但是由于对虾肠道细胞的内容物和菌群比较多，很容易造成污染，且对虾肠道又比较小，操作较为困难。

技术实现思路

[0004]针对上述问题，本专利技术的目的在于提供一种虾肠道细胞提取和培养的方法。
[0005]本专利技术的
技术实现思路
如下：
[0006]本专利技术提供了一种虾肠道细胞提取和培养的方法，包括如下步骤：
[0007]1)饥饿处理：选取对虾，将其置于含四抗液的煮沸的2
‰
的海盐中进行饥饿处理一天；
[0008]所述四抗液为青霉素、链霉素、庆大霉素和支原体清除剂的混合溶液；
[0009]所述青霉素、链霉素、庆大霉素和支原体清除剂的使用体积比为1:1:1:1；
[0010]所述青霉素的使用浓度为100U/mL；
[0011]所述链霉素的使用浓度为0.1mg/mL；
[0012]所述庆大霉素的使用浓度为50μg/mL；
[0013]所述支原体清除剂MRA(ZT10002)的使用浓度为0.39μg/mL；
[0014]2)消毒：采用酒精对对虾的表面进行消毒处理，采用含5
×
四抗液的Dhanks液对虾肠道进行处理，可以有效抑制肠道内容物和肠道细菌的感染；
[0015]所述含5
×
四抗液的Dhanks液中，Dhanks液的成分成分包括NaCl、KCl、KH2PO4、NAHCO3；
[0016]3)肠道收集和消化：收集消毒后的虾肠道于细胞筛中，加入消化液进行研磨，吸取滤过细胞筛的消化液于EP管中，26～28℃、200rpm的摇床进行消化，将消化处理得到的消化液加入含胎牛血清的M199完全培养基终止消化；
[0017]所述消化液包括胶原蛋白酶IV和胶原蛋白酶I，其使用体积比为1：(1～3)；
[0018]所述胶原蛋白酶IV的使用浓度为0.1～0.3mg/mL；
[0019]所述胶原蛋白酶I的使用浓度为0.1～0.3mg/mL；
[0020]4)肠细胞的收集和培养：取消化液进行第一次离心处理，常温下300rpm离心5min，收集上清后弃沉淀；
[0021]再将上清液进行第二次离心处理，常温下500rpm离心5～8min，弃上清，用含胎牛血清的M199完全培养基进行细胞重悬；
[0022]对重悬后的细胞进行计数后铺于提前用鼠尾胶原Ⅰ型蛋白包被好的培养板中，置于26～28℃、6％的CO2培养箱中培养，48h之后进行扩培或换液处理，得到虾肠道细胞；
[0023]所述鼠尾胶原Ⅰ型蛋白包被好的培养板的制备为：配制24μL的鼠尾胶原+10mL 0.06moL/L HAC形成0.012mg/mL胶原蛋白溶液，培养板的每一孔加600μL配好的0.012mg/mL胶原蛋白溶液，确保胶原蛋白溶液铺满器皿的表面，开盖在超净台上过夜晾干，也可以室温放置1h后，用PBS洗3～4次后直接使用。
[0024]所述M199完全培养基中的组分包括质量体积百分比为15％的胎牛血清、NaCl 5～6g/L，葡萄糖1～3g/L，碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)20μg/L，余量为M199基础培养基，1
×
四抗液，渗透压为470～550mmol/kg。
[0025]本专利技术的有益效果如下：
[0026]本专利技术的虾肠道细胞提取和培养的方法，首先将对虾养在含四抗液的煮沸的2
‰
的海盐中饥饿处理一天，将对虾浸泡在75％的酒精中5～10min，对其表面进行消毒，在清洗肠道时使用5
×
的四抗液，可以有效抑制肠道内容物和肠道细菌的污染。使用梯度离心，有效去除碎片，得到比较干净的背景；所采用的培养基，使用NaCl和葡萄糖调节渗透压，达到适合虾肠道细胞的生长的渗透压，防止细胞在低渗透压时破裂；使用鼠尾胶原I型蛋白包被培养板可以有效的促进虾细胞生长；以及使用消化液和细胞筛可以有效减少细胞碎片，且只需10min就可以从肠道组织里面释放出细胞，所使用的胶原蛋白酶Ⅳ和胶原蛋白酶Ⅰ混合使用有效地提取到虾肠细胞，此比例的使用显著提高了虾肠道组织的消化效率，大大缩短了提取的时间。
附图说明
[0027]图1为对比例1处理的虾肠细胞状态图；
[0028]图2为对比例2的处理的虾肠细胞状态图；
[0029]图3为对比例3的处理的虾肠细胞状态图；
[0030]图4为200rpm，5min(72h)离心处理下的细胞状态；
[0031]图5为500rpm，5min(72h)离心处理下的细胞状态；
[0032]图6为1000rpm，5min(4h)离心处理下的细胞状态。
具体实施方式
[0033]以下通过具体的实施案例以及附图说明对本专利技术作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的保护范围，在阅读了本专利技术之后，本领域技术人员对本专利技术的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。
[0034]若无特殊说明，本专利技术的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
[0035]实施例1
[0036]一种虾肠道细胞提取和培养的方法
[0037]1)饥饿处理：选取对虾，将其置于含四抗液的煮沸的2
‰
的海盐中进行饥饿处理一天；
[0038]所述四抗液为青霉素、链霉素、庆大霉素和支原体清除剂的混合溶液，其使用体积比1:1:1:1；
[0039]所述青霉素的使用浓度为100U/mL；
[0040]所述链霉素的使用浓度为0.1mg/mL；
[0041]所述庆大霉素的使用浓度为50μg/mL；
[0042]所述支原体清除剂MRA(ZT10002)的使用浓度为0.39μg/mL；
[0043]2)消毒：采用酒精对对虾的表面进行消毒处理，采用5～8mL含5
×
四抗液的Dhanks液对虾肠道进行处理3～5遍，可以有效抑制肠道内容物和肠道细菌的感染；
[0044]所述含5
×
四抗液的Dhan本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种虾肠道细胞提取和培养的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)饥饿处理：选取对虾，将其置于含四抗液的煮沸的2
‰
的海盐中进行饥饿处理一天；2)消毒：采用酒精对对虾的表面进行消毒处理，采用含5
×
四抗液的Dhanks液对虾肠道进行处理，用于抑制肠道内容物和肠道细菌的感染；3)肠道收集和消化：收集消毒后的虾肠道于细胞筛中，加入消化液进行研磨，吸取滤过细胞筛的消化液于EP管中进行消化，将消化处理得到的消化液加入含胎牛血清的M199完全培养基终止消化；所述消化液包括胶原蛋白酶IV和胶原蛋白酶I，其使用体积比为1：(1～3)；4)肠细胞的收集和培养：取消化液进行第一次离心处理，收集上清后弃沉淀；再将上清液进行第二次离心处理，弃上清，用含胎牛血清的M199完全培养基进行细胞重悬；对重悬后的细胞进行计数后铺于培养板中，置于培养箱中培养，之后进行扩培或换液处理，得到虾肠道细胞。2.由权利要求1所述的虾肠道细胞提取和培养的方法，其特征在于，步骤1)所述四抗液为青霉素、链霉素、庆大霉素和支原体清除剂的混合溶液；所述青霉素、链霉素、庆大霉素和支原体清除剂的使用体积比为1:1:1:1。3.由权利要求2所述的虾肠道细胞提取和培养的方法，其特征在于，所述青霉素的使用浓度为100U/mL；所述链霉素的使用浓度为0.1mg/mL；所述庆大霉素的使用浓度为50μg/mL；所述支原体清除剂的使用浓度为0.3...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭凯，黄文，邱建强，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物科学研究所，
类型：发明
国别省市：