一种人胎盘间充质干细胞来源的外泌体制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种人胎盘间充质干细胞来源的外泌体制备方法及应用，制备方法为：步骤一，人胎盘来源间充质干细胞的原代培养；1，材料获取；2，分离培养；3，换液和传代；4，冻存与复苏；5，细胞表面抗原检测；步骤二，人胎盘间充质干细胞来源外泌体(PMSCs

【技术实现步骤摘要】
一种人胎盘间充质干细胞来源的外泌体制备方法及应用


[0001]本专利技术公开了一种人胎盘间充质干细胞来源的外泌体制备方法及应用，涉及生物与新医药


技术介绍

[0002]间充质干细胞(MSC)是一种可以自我更新并分化成各种细胞谱系的细胞。在过去的几十年中，已经发现来自各种组织的MSCs可以通过其分化和/或分泌功能产生治疗效果。与其他组织相比，人胎盘是一种理想的MSCs储存库，可以通过非侵入性方式获得MSCs，并且很少引起伦理问题。此前有报道称，人胎盘来源的间充质干细胞(hPMSC)移植可以恢复卵巢功能，保护脑缺血再灌注损伤后的脑功能，减轻脊髓损伤等。然而，MSCs移植治疗受到细胞保留率和肿瘤发生潜在风险的限制。更重要的是，许多研究发现其治疗效果主要归因于间充质干细胞的分泌功能，如细胞因子、生长因子和外泌体。
[0003]外泌体是细胞外囊泡(EVs)的一种，可通过促进细胞间各种RNA、DNA、细胞因子和生长因子的转移，作为细胞间通讯的一种手段。自2004年在人胎盘中发现hPMSCs并证实其多向分化潜能以来，近年来以hPMSCs及其外泌体为基础的疾病治疗研究逐渐增多。除了hPMSCs可以直接对疾病产生治疗作用外， hPMSCs衍生的外泌体也具有治疗潜力。
[0004]慢性疼痛的发生往往由多种因素所介导，包括炎症性疼痛，神经病理性疼痛，癌症相关性疼痛等。炎症是免疫系统消除有害刺激，恢复内环境平衡的重要机制。然而，有害刺激和炎症的持续存在是许多慢性炎症性疾病的基础，包括糖尿病、心血管疾病、关节炎等。在这种情况下，炎症不再是身体的保护性反应，并可能引起以痛觉过敏、异常性疼痛和特发性疼痛为特征的持续性慢性疼痛，并释放多种促炎介质，包括细胞因子、趋化因子、神经生长因子等，导致外周伤害感受器的敏化。神经病理性疼痛(Neuropathic pain, NeuP)是由物理性的机械损伤、代谢或营养性神经改变、病毒感染、药物或放疗的神经毒性、缺血性神经损害、神经递质功能障碍等多种因素引发的慢性疼痛，表现为自发性疼痛、痛觉过敏、异常疼痛和感觉异常等临床特征。2011年国际疼痛研究协会(International Association for the Study of Pain,IASP)将神经病理性疼痛(Neuropathic pain,NeuP)定义更新为“由躯体感觉神经系统的损伤或疾病而直接造成的疼痛”，各国流行病学调查显示NeuP发病率在6
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10％之间，且发病率呈逐年增加趋势。癌症相关性疼痛包括化疗药物诱导的神经痛，通常是由长春新碱或紫杉醇等化疗药物所介导。慢性疼痛的发病机制复杂，主要包括离子通道功能变化、神经炎症、外周和(或)中枢敏化、上行和下行通路功能失调、脊髓胶质细胞的活化等。目前临床治疗慢性疼痛尚无较好方案，数据表明至少有50％的患者未能获得有效的疼痛缓解，严重影响了患者的生活质量，增加了个人和社会经济负担。综上所述，探寻对于各种慢性疼痛更有效的治疗药物和方案具有重要的临床和社会意义。
[0005]据目前的相关报道，MSCs衍生的外泌体在慢性疼痛模型中表现出有希望的治疗潜力。但是，hPMSCs 来源的外泌体是否能缓解包括炎症性疼痛，神经病理性疼痛，癌症相关性疼痛等在内的慢性疼痛及其可能机制尚未见报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在提供一种人胎盘间充质干细胞来源的外泌体制备方法，探讨hPMSCs
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exosomes对不同类型慢性疼痛(炎性疼痛，神经病理性疼痛，化疗药物所致疼痛)的治疗作用，实现本专利技术专利的核心用途：鞘内注射hPMSCs
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exosomes能够通过其内容物的免疫调节和抗炎作用产生缓解/治疗不同类型慢性疼痛的作用，具体包括：1)明确hPMSCs
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exosomes缓解/治疗不同类型慢性疼痛的作用；2)明确hPMSCs
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exosomes 缓解/治疗不同类型慢性疼痛所导致的炎症反应，为后续开发生物治疗药物奠定基础。
[0007]与普通药物治疗相比，人胎盘间充质干细胞衍生的外泌体具有以下优点：1)镇痛效果明显且持久；2) 易于获取与制备；3)无明显不良反应；4)蛋白质、活性因子和生物活性物质含量高、活性强；5)更灵活，更易于生物改造。
[0008]而我们的胎盘间充质干细胞衍生的外泌体和其他间充质干细胞外泌体相比，可以通过非侵入的方式获取，更简易。此外，也面临更少的伦理问题。与单独miRNA治疗疼痛相比，通过外泌体中包含多种活性物质，这些物质如蛋白质、非编码RNA如miRNA均可能产生缓解疼痛、抗炎等作用；其次以外泌体为载体给药，可以显著提高生物吸收率，减少不良反应，提高给药效率。
[0009]具体技术方案：
[0010]1.1研究方法和实验方案
[0011]1.1.1人胎盘来源间充质干细胞的原代培养
[0012](1)材料获取：获得医院伦理委员会批准，与健康产妇及其家属签署知情同意书后，于胎盘娩出后立即取5mL胎盘后置于冰盒内，避免组织与冰袋的直接接触，1h内转移至实验室，准备实验。
[0013](2)分离培养
[0014]1)剪取胎儿侧绒毛膜组织5mL，置于10cm培养皿，皿中装有2/3体积含有1％双抗的PBS。
[0015]2)除去取得胎盘组织的羊膜部分，用组织剪将较大组织剪成小块，并用手术镊夹持清洗，避免溢出，如此反复3遍，至漂洗液清亮，弃除漂洗液。
[0016]3)将漂洗好的绒毛膜组织剪细至5mm3左右，转移绒毛膜组织至50mL体积的离心管中。
[0017]4)向各离心管中加入II型胶原酶消化液，各加入等体积II型胶原酶(酶消化终浓度0.1％)，置于摇床内37℃、250rpm震荡，约60min后终止消化。(置于37℃孵箱/水浴箱内，每5min轻轻震荡离心管，使其消化充分)
[0018]5)加完全培养基至50mL，300rpm、5min离心，过70μm细胞筛收集上清。
[0019]6)分为20mL/管，加完全培养基至50mL，2000rpm、10min离心，弃上清。
[0020]7)10mL完全培养基重悬细胞，将两管合并混匀。加完全培养基至50mL，接种至5皿10cm直径培养皿。置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
[0021](3)换液和传代：每3天换液一次。细胞生长至80％时，每皿加入1.0
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2.0mL的0.25％胰酶(含EDTA) 进行消化传代。传代时，消化三至四分钟，加含有血清的细胞培养液终止消化，将细胞悬液转移至50mL 离心管中，并补加完全培养基至50mL，1200rpm，离心5min，弃含消化液的上清，加入细胞完全培养液吹打混匀，计数，按照约1.5
×
106/皿接种于
直径10cm的细胞培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
[0022](4)冻存与复苏
[0023]本研究采用冷冻保护液：5％二甲基亚砜(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人胎盘间充质干细胞来源的外泌体制备方法，其特征在于，按照下述方法制备，具体步骤为：步骤一：人胎盘来源间充质干细胞的原代培养(1)材料获取：获得医院伦理委员会批准，与健康产妇及其家属签署知情同意书后，于胎盘娩出后立即取5ml胎盘后置于冰盒内，避免组织与冰袋的直接接触，1h内转移至实验室，准备实验；(2)分离培养：剪取胎儿侧绒毛膜组织，置于培养皿，皿中装有2/3体积含有1％双抗的PBS；除去组织的羊膜部分，将组织剪成小块，反复清洗，至漂洗液清亮；将漂洗好的绒毛膜组织剪细至5mm3左右，转移绒毛膜组织至50mL体积的离心管中；向各离心管中加入II型胶原酶消化液，消化约50～70min终止；加完全培养基至50mL，300rpm、5min离心，过70μm细胞筛收集上清；分为20mL/管，加完全培养基至50mL，2000rpm、10min离心，弃上清；10mL完全培养基重悬细胞，将两管合并混匀；加完全培养基至50mL，接种至5皿直径10cm的培养皿；置于37℃，5％CO2培养箱中培养；(3)换液和传代：每3天换液一次；细胞生长至80％时，每皿加入1.0～2.0mL的0.25％胰酶进行消化传代；传代时，消化3～4min，加含有血清的细胞培养液终止消化，将细胞悬液转移至50mL离心管中，并补加完全培养基至50mL，1200rpm，离心5min，弃含消化液的上清，加入细胞完全培养液吹打混匀，计数，按照约1.5
×
106/皿接种于细胞培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养；(4)冻存与复苏：采用冷冻保护液：5％二甲基亚砜+50％标准胎牛血清+45％DMEM/F12；复苏培养：解冻时从液氮罐中取出冷冻管，将其放入37℃水浴锅迅速融化约1～2min或放入37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中使其融化；将冻存管中液体加入有培养基的离心管中，1500...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶涛，陆羿天，侯鸿浩，刘帅，秦再生，
申请(专利权)人：陶涛，
类型：发明
国别省市：