一种重组产朊假丝酵母尿酸酶的纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种重组产朊假丝酵母尿酸酶的纯化方法，属于生物技术领域。具体涉及一种重组产朊假丝酵母尿酸酶的纯化方法，即将表达重组尿酸酶的大肠杆菌细胞裂解物上清依次经过聚乙烯亚胺絮凝、硫酸铵盐析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、凝胶过滤层析脱盐和冷冻干燥，得到高纯度重组产朊假丝酵母尿酸酶。本发明专利技术具有生产周期短、目的产物纯度高的优势，部分产品质量指标得到了有效改进，整个工艺过程具有易于控制和规模化放大生产等特点。艺过程具有易于控制和规模化放大生产等特点。艺过程具有易于控制和规模化放大生产等特点。

【技术实现步骤摘要】
一种重组产朊假丝酵母尿酸酶的纯化方法


[0001]本专利技术涉及利用重组DNA技术生产基因工程药物，具体涉及一种来源于产朊假丝酵母的尿酸酶重组蛋白的纯化方法，属于生物


技术介绍

[0002]公开号为CN104342415A的专利技术专利《一种重组尿酸酶的制备方法》公开了一种适合大肠杆菌分泌表达重组产朊假丝酵母尿酸酶(Uricase,EC1.7.3.3)的核苷酸序列及从该工程细胞纯化重组产朊假丝酵母尿酸酶的方法，但该专利中所涉及的纯化方法为实验室规模的方案，方案中所用的凝胶过滤层析纯化步骤，存在着上样量限制(一般为柱体积的2～5％左右)，不易放大到工业化生产的规模，同时，此纯化方案无法彻底去除宿主细胞的DNA，造成最终产品中外源DNA超标，目前尚未有可以工业化应用的重组产朊假丝酵母尿酸酶制备的生产方法。

技术实现思路

[0003]本专利技术根据工业化生产要求，提供一种重组产朊假丝酵母尿酸酶制备的生产方法。
[0004]该方法在菌体破碎后，首先采用聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine，PEI)絮凝，去除宿主核酸，降低溶液粘度、宿主DNA残留和后续层析的操作负荷，然后利用重组产朊假丝酵母尿酸酶与杂蛋白的理化性质差异，直接采用阴离子交换层析纯化，即可获得纯度比较高的重组蛋白，为了保证产品质量，又进行了阳离子交换层析，有效避免了产品中聚合体存在的风险，解决了原有工艺存在单位批次处理量小，生产周期长，部分产品质量指标不合格的缺点。本专利技术采用的技术方案，具体由以下步骤组成：
[0005](1)菌体破碎：按质量体积比1∶5～50重悬于破菌缓冲液(1
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PBS，pH7～8)中破碎，高速离心，得上清备用；菌体破碎可采取超声、均质以及溶菌酶等破菌方式；
[0006](2)PEI絮凝去除核酸：在(1)破菌离心上清中，加入终浓度为0.2～0.5％(V/V)的聚乙烯亚胺(MW70,000)，搅拌絮凝后，离心收集上清备用；
[0007](3)硫酸铵盐析浓缩：按照终浓度60～70％饱和硫酸铵要求，在(2)制备的上清中加入相应克重硫酸铵粉末，充分搅拌絮凝，待盐析结束后，离心得到蛋白沉淀并采用(4)缓冲液A复溶备用；
[0008](4)阴离子交换层析；
[0009]缓冲液A的制备：25mmol/L Tris
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HCl，pH8.0；
[0010]缓冲液B的制备：25mmol/L Tris
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HCl、1mol/L氯化钠，pH8.0；
[0011]通过调整和控制平衡缓冲液及样品液的电导≥3.2ms/cm，采用缓冲液A进行填料平衡后，采取柱上直接流穿方式，收集流穿目的峰；
[0012]所述步骤(4)阴离子交换层析所用填料，可选择采用DEAE
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Sephrose、Q
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Sepharose、DEAE
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Cellulose、DEAE
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Sephacel、Q
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Cellulose或Q
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Sephacel填料；
[0013](5)阳离子交换层析；
[0014]填料平衡后，调整阴离子收集液的pH和电导后，直接上样，待冲洗至基线后，可进行线性或梯度洗脱；
[0015]所述步骤(5)阳离子交换层析填料，可采用CM
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Sephrose、SP
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Sepharose、CM
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Cellulose、CM
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Sephacel、SP
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Cellulose或SP
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Sephacel；
[0016](6)置换缓冲液
[0017]采用Sephadex G25脱盐柱进行缓冲液置换；
[0018](7)制剂冻干；
[0019]根据成品配方，进行冻干前原液调配并分装，置于
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80℃预冻2小时以上后，采用冷冻干燥机冷冻干燥。
[0020]优选的，步骤(4)中所述，阴离子交换层析优选Q
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Sepharose FF。
[0021]优选的，步骤(4)中所述缓冲液A配方和样品液通过添加氯化钠控制电导在3.2～3.5ms/cm，这样即可能保证蛋白纯度又可避免内毒素和核酸被洗脱。
[0022]优选的，步骤(5)中所述，阳离子交换层析优选SP阳离子交换。
[0023]优选的，步骤(5)中所述，采用0～6％B线性洗脱，收集目的洗脱峰。
[0024]优选的，步骤(7)成品配方采用每毫升缓冲液(2.6～14.3克磷酸氢二钠/100ml纯化水)中含1.5mg重组尿酸氧化酶(Uricase)、10.6mg甘露醇、15.9mg L
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丙氨酸；
[0025]综上所述，本专利技术方案达到初步纯化的目的，层析处理量不再受5％上样量的限制。相比，整个生产周期缩短了30％，单支成本降低了40％，同样获得了高质量的产品，经检测，本专利技术制备的重组产朊假丝酵母尿酸酶电泳纯度可以达到95％以上，外源性DNA残留量也大大减小，指标也符合了药典要求。与原专利技术相比，本专利技术处理量大、生产周期短、目的产物纯度高、部分产品质量指标得到了明显改进，整个工艺方案具有易于控制和规模化放大等特点。
附图说明
[0026]附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：
[0027]图1为重组蛋白表达图；
[0028]图1中，1：重组蛋白诱导前全菌蛋白；2：重组蛋白诱导3小时全菌蛋白；3：重组蛋白诱导7小时全菌蛋白；
[0029]图2为阴离子交换层析色谱图；
[0030]图3为阳离子交换层析色谱图；
[0031]图4为阴离子交换层析目的峰SDS
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PAGE(15％分离胶)图；
[0032]图4中，1：预染蛋白Marker；2：阴离子交换层析蛋白峰1(流穿)；3：阳离子交换层析蛋白峰2(洗脱)；
[0033]图5为成品冻干粉复溶SDS
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PAGE(12％分离胶)纯度分析图；
[0034]图5中，1：预染蛋白Marker；2：冻干粉复溶样品。
具体实施方式
[0035]以下结合附图对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0036]实施例
[0037]参照专利CN104342415A提供的方法，发酵结束后，离心收集菌体，进行SDS
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PAGE蛋白表达分析，见图1，由泳3可以看出重组蛋白有明显表达，并采用1
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PBS缓冲液重悬清洗菌体一遍后，将菌泥冻存备用或直接处理。
[0038](1)菌体破碎：
[0039]按菌体质量体积比1∶10(g(湿重)/ml)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组产朊假丝酵母尿酸酶的纯化方法，其特征在于：其具体步骤为：(1)菌体破碎：将菌体按质量体积比1∶5～50重悬于pH7～8、1
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PBS缓冲液中破碎，20,000g离心30min，得上清备用；(2)PEI絮凝去除核酸：在步骤(1)所得的上清中，加入终浓度为0.2～0.5％(w/v)的聚乙烯亚胺(MW70,000)，搅拌絮凝后，离心收集上清备用；(3)硫酸铵盐析浓缩；在步骤(2)所得的上清中加入相应量的固体硫酸铵粉末，使其终浓度达到60～70％硫酸铵饱和度，缓慢搅拌一段时间，离心收集沉淀，将其复溶于25mmol/L Tris
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HCl、pH8.0的缓冲液中，备用；(4)阴离子交换层析；缓冲液A的制备：25mmol/L Tris
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HCl，pH8.0；缓冲液B的制备：25mmol/L Tris
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HCl、1mol/L氯化钠，pH8.0；用缓冲液A平衡阴离子交换柱后，通过调整和控制平衡缓冲液及样品液的电导值，采取柱上直接流穿方式，收集相应目的峰；(5)阳离子交换层析；缓冲液A的制备：20mmol/L磷酸氢二钠
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磷酸二氢钾缓冲液，pH6.0；缓冲液B的制备：20mmol/L磷酸氢二钠
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磷酸二氢钾缓冲液、1mol/L氯化钠，pH6.0；先用缓冲液B冲洗CM
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Sepharose Fast Flow(GE Healthcare...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙昌荣，刘昶，李利华，
申请(专利权)人：北京云禾天秤生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：