一种检测阪崎克罗诺杆菌的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种检测阪崎克罗诺杆菌的方法及其应用。所述方法包括：识别阪崎克罗诺杆菌基因组序列中富含AT碱基的序列作为目标序列；针对目标序列自动化、高通量地设计特异性引物；设计特定的Tm值计算公式计算反应变性及退火温度，并据此设置核酸扩增反应条件；在模板局部解链的条件下进行核酸扩增反应。本发明专利技术靶向传统核酸扩增方法通常需要规避的富含AT碱基的序列，极大地拓宽候选靶标区域；通过基于海量基因组数据的特异性排查，以及针对富含AT区域的Tm值的精确计算，实现双链DNA的局部解链，降低核酸扩增技术中非特异性扩增的可能性。该方法有效拓展传统核酸扩增技术的应用范围，同时在引物设计通量、反应特异性等显著提升反应性能。提升反应性能。

【技术实现步骤摘要】
一种检测阪崎克罗诺杆菌的方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测阪崎克罗诺杆菌的方法及其应用，所述方法是一种专门针对阪崎克罗诺杆菌的基因组序列进行核酸扩增的方法。

技术介绍

[0002]核酸扩增技术(nucleic acid amplification technology，NAAT)是一类分子生物学技术的总称，这类技术通过引物、DNA聚合酶和其它试剂在特定温度下进行反应，实现微量核酸的快速、特异性扩增，可广泛应用于疾病诊断、病原微生物检测、食品安全检测、动植物检疫以及涉及分子克隆的各项应用，如测序、基因克隆、基因操作、等位基因分析、突变检测等。其中聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是最早实现应用的核酸扩增技术，它模仿DNA在体内复制的过程，通过一对特异的寡核苷酸引物与待扩增DNA片段互补，再经过若干个循环的变性、退火、延伸过程，实现DNA片段的指数级扩增。PCR技术由Cetus公司的Mullis于1985年专利技术，随后Saiki等人将热稳定DNA聚合酶引入PCR反应体系，解决了早期PCR技术因热变性循环过程中DNA聚合酶钝化导致需要不断人工添加聚合酶的缺点，大大提高了核酸扩增效率并使该技术可以实现自动化，自此以后，以PCR为代表的核酸扩增技术得到广泛的推广和应用，也极大的推动了分子生物学的发展。
[0003]众所周知，现有核酸扩增技术通常会避开富含GC或AT的区域，其原因在于，这些区域易通过自身互补配对形成发夹环二级结构，从而阻碍引物与模板的结合；即使引物与模板能够勉强结合，也容易影响DNA聚合酶延模板链的延伸，从而导致DNA聚合酶沿模板扩增时“卡顿”并干扰DNA合成。因此，为了提高反应成功率，传统的核酸扩增技术对扩增区域的碱基组成具有选择偏好性，其引物设计往往集中在GC含量40％～60％的区域，以45％～55％为最适宜，不同扩增技术略有差别，如PCR的引物设计建议G+C含量为40％～60％(见分子克隆实验指南第四版，表7
‑
1引物设计)，LAMP引物设计建议G+C含量为40％～65％(见A Guide to LAMP primer designing(PrimerExplorer V3))。
[0004]然而，自然界中生物体的核酸碱基组成差别巨大，如疟原虫基因组AT碱基含量约为82％，周慧琦等研究了2670株细菌和古细菌，发现其基因组GC含量变化范围从14％到75％(周慧琦,2014)。从检测角度讲，现有核酸扩增技术的碱基组成选择偏好性忽略了大量潜在的靶序列，放大了目标对象被成功检出的难度；从基因操作角度讲，该选择偏好性导致相当多的目标序列难以被顺利扩增，从而难以开展进一步分子操作。如能针对传统核酸扩增方法所回避的GC碱基含量、AT碱基含量非均衡域设计适当的引物，避免形成二级结构，同时设置适宜的反应条件，顺利开展核酸扩增实验，将显著增加目标对象被检出的成功率，同时使得更多序列能够被扩增进而方便地实施下游分子操作。
[0005]针对GC碱基含量、AT碱基含量非均衡区域开展核酸扩增反应，其关键步骤是引物设计环节。鉴于以上分析，领域内公开发布的种属特异基因(或序列)通常来自于GC含量40％～60％甚至45％～55％的区域，因而无法应用于针对GC、AT碱基含量非均衡区域的引物设计。另外，此类序列中连续存在的GC
‑
rich或AT
‑
rich区，其碱基组成多样性相比其它区
域偏弱，又为特异性引物的设计带来额外的困难。因此首先需要提出一套能够针对GC、AT碱基含量非均衡序列进行高通量、自动化、高效率的引物设计算法流程。
[0006]除了扩增区域选择和引物设计外，扩增区域和引物的Tm值计算也是扩增过程能否顺利完成的重要影响因素。扩增区域和引物的Tm值通常按照最近邻二态模型进行计算，但是不同研究者及引物生产公司采用的具体计算公式各有不同，如分子克隆实验指南第四版中建议的引物Tm计算公式为Tm＝4
×
(G,C数)+2
×
(A,T数)，TaKaRa公司建议的引物Tm计算公式为Tm＝4
×
(G,C数)+2
×
(A,T数)+32
‑2×
(总碱基数)；生工生物的引物Tm计算公式为Tm(0.05MNa
+
)＝59.94+1
×
(GC的百分含量)
‑
(675/引物序列长度)。对于GC、AT碱基含量非均衡区域而言，应当如何设计模型进行引物Tm值计算，成为确保实验成功的重要因素。
[0007]综上所述，领域内亟需发展一种针对传统核酸扩增技术难以涉及的区域的核酸扩增技术，能够高通量、自动化地设计特异性引物，计算其Tm值，并设置适宜的变性温度、退火温度等反应条件，拓展核酸扩增技术的应用范围，提升扩增的特异性，满足核酸检测、分子遗传学研究等多方面的需求。

技术实现思路

[0008]本专利技术提出了一种创新的核酸扩增方法，并应用于检测阪崎克罗诺杆菌。该方法以富含AT的核酸序列为扩增目标，进行目标序列识别、引物设计、变性温度及退火温度计算、模板局部解链的核酸扩增等。首先，采用自动化的引物设计流程，充分利用公共数据资源中丰富的基因组序列信息，高通量地设计针对富含AT的目标序列的特异性引物对。其次，拟合了符合富含AT序列特点的Tm值计算公式，可根据理论扩增产物序列及引物的序列长度、碱基组成等因素计算变性温度和退火温度；考虑到富含AT的核酸序列变性温度显著低于GC含量40％～60％以及高GC的序列，因此将计算所得的理论扩增产物序列Tm值作为最低变性温度，在该温度下，能够在不添加任何化学变性剂的前提下，对双链DNA的富含AT区域进行局部解链，进而启动核酸扩增反应。
[0009]本专利技术一方面在引物设计环节引入公共数据资源中的海量基因组数据，进行序列特异性排查；另一方面，在变性温度设置环节有别于传统核酸扩增方法在93～95℃变性温度下打开所有双链结构，而是通过降低变性温度仅打开富含AT序列，从而在源头上极大地减少了非靶向区域发生非特异扩增的可能性。这两方面的设计策略显著降低了核酸扩增反应中常见的非特异性扩增的可能性，在此基础上形成了针对富含AT序列的核酸扩增方法。该方法的引物设计步骤采用C语言和Perl语言编程实现，具有高通量、自动化的特点，整个扩增方法特异性强、成功率高，有效地拓展了传统核酸扩增技术的应用范围，显著提升了反应性能。
[0010]本专利技术中，所述核酸扩增方法包括识别待扩增核酸序列中富含AT碱基的序列作为目标序列；针对目标序列自动化、高通量地设计特异性引物；设计特定的Tm值计算公式计算反应变性及退火温度，并据此设置核酸扩增反应条件；在模板局部解链的条件下进行核酸扩增反应。
[0011]具体包括如下步骤：
[0012](1)筛选待扩增核酸序列中富含AT碱基的目标序列；
[0013](2)针对所述目标序列自动化、高通量地设计兼具通用性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测阪崎克罗诺杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)筛选阪崎克罗诺杆菌基因组序列中富含AT碱基的目标序列；(2)针对所述目标序列设计兼具通用性和特异性的引物；(3)基于GC的百分含量、引物序列长度、引物对的理论扩增产物序列长度计算反应变性温度及退火温度，并设置核酸扩增反应条件；(4)在模板局部解链的条件下进行核酸扩增反应，得到扩增产物。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，对于所述阪崎克罗诺杆菌基因组序列，从第一个碱基开始滑动宽度为1000bp的窗口，步长为5～100bp；针对每次窗口所在位置包含的序列计算AT碱基含量，保留序列AT碱基含量大于60％的区域作为目标序列。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述引物的设计方法包括：(2.1)针对一条目标序列进行单条引物设计，得到候选引物；(2.2)对所述候选引物进行理化性质判定，筛选符合要求的单条引物；(2.3)将步骤(2.2)筛选得到的单条引物组合成引物对；(2.4)对所述引物对进行通用性、特异性判定；(2.5)输出符合条件的引物对，得到所述特异性引物。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2.1)中，所述候选引物需满足以下条件：a)引物序列长度在20bp～36bp之间；b)AT碱基含量在55％～80％；c)连续GC数≤5；同时记录所述候选引物匹配到所述目标序列上的位置信息、正负链信息；和/或，步骤(2.2)中，对满足上述(2.1)条件的所述单条引物进行理化性质判定，包含3
’
端稳定性、5
’
端稳定性和/或二级结构稳定性。5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2.3)中，对上述步骤(2.2)筛选得到的单条引物，根据所述单条引物匹配到所述目标序列上的位置信息、正负链信息，将所述单条引物组合成引物对；所述引物对的理论扩增产物序列的长度应在200bp～600bp之间；根据公式0.466
×
(GC的百分含量)
×
100+66.04
‑
(450/引物序列长度)计算单条引物的Tm值；以引物对Tm差值≤3℃，以及引物之间不能发生相互作用为条件，对引物对进行筛选，得到候选引物对；其中，GC的百分含量是指引物中的碱基G和C的个数占引物总碱基个数的百分比；引物序列长度是指引物的碱基个数。6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2.4)中，所述通用性判定指检查引物对可否严格匹配到所有的目标序列；特异性判定指检查单条引物是否不能与所有目标序列之外的非目标序列发生特异性匹配，所述非目标序列指除待扩增核酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹永梅，陈俊江，陈清艳，杨政华，吉玲，林彦君，李园园，刘伟，陆晓婷，李雪玲，陆长德，王涤松，李亦学，
申请(专利权)人：上海生物信息技术研究中心，
类型：发明
国别省市：