贵州玛瑙红樱桃植原体的LAMP快速检测方法技术

本发明专利技术公开了一种樱桃植原体病害的LAMP快速检测方法，本发明专利技术针对樱桃植原体16SrDNA基因保守序列的6个区域设计2对特异性引物，利用一种链置换DAN聚合酶在等温60℃条件下，可实现1小时内的核酸高效扩增，4条引物对靶基因6个特异序列区域的识别，保证了LAMP扩增的高效性；LAMP无需模板的热变性及长时间温度的循环，只需在恒温条件下扩增，反应速度可大大的提高。该检测技术具有快速高效、操作简便、结果可视化、成本低，易在基层推广的特点，将在樱桃植原体的早期检测、田间诊断及樱桃种苗带菌检测发挥很大的作用，为樱桃植原体病原检测、科学防控等提供技术支撑和参考依据。学防控等提供技术支撑和参考依据。学防控等提供技术支撑和参考依据。

【技术实现步骤摘要】
贵州玛瑙红樱桃植原体的LAMP快速检测方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种利用环导等温扩增技术检测玛瑙红樱桃植原的


技术介绍

[0002]植原体是一类无细胞壁、不能人工培养、存在于植物筛管内的专性寄生菌，世界各地已报道植原体可引起1000余种各类植物系统性病害，涵盖农作物、园艺、花卉、果树和林木等。该病害传播性强、症状明显、危害较大，可不同程度引起植物生长发育异常或变异，甚至造成植株死亡。樱桃植原体病害就是其中一种，近年来该病害已经成为威胁樱桃产业发展最为重要的病害之一，主要引起樱桃花变叶（绿）及花器官、叶片、果实的生长发育异常和变异，并最终导致植株2~5a（年）内迅速死亡，对我国乃至世界樱桃产业造成了非常重大的损失。早期的检测，及时发现感病植株中植原体的存在，为进一步开展樱桃植原体病害研究与防控具有重要意义，因此建立和应用先进的病原检测技术至关重要。
[0003]目前广泛应用于植原体的分子检测技术主要是巢式PCR（Nested PCR）和实时荧光PCR（Real
‑
time PCR）等，这些检测方法需要的仪器设备较昂贵，且检测时间较长、过程繁琐，对操作人员有较高的技术要求，限制了这些技术在基层单位、中小型企业的推广。换介导等温扩增技术（loop
‑
mediatedisothermalamplification, LAMP）是Notomi等专利技术的一种新型核酸扩增技术（Notomi, 2002）。该技术具有特异性强、操作简单快捷、无需要昂贵和复杂的实验仪器、无须电泳及紫外观察，可直接通过肉眼观察检测结果等优点。除此之外，与PCR技术相比，该技术耗时短、灵敏度高，非常适合于基层及现场的使用。
[0004]LAMP方法被广泛的应用于植物病原菌的检测，近年来该技术也在一些植原体的检测中得到了应用。如以16S RNA基因作为靶基因建立了海南槟榔黄化植原体和枣疯病植原体的LAMP检测方法；韩剑等以tuf基因作为靶标建立新疆杏褪绿卷叶植原体了LAMP检测技术，王洁等以tuf基因为靶标建立的5种植原体的环介导恒温扩增技术。但目前，尚未见利用LAMP方法检测樱桃花变绿植原体病害的报道。

技术实现思路

[0005]在樱桃植原体病害的检测技术中专门利用LAMP技术检测的尚未见有报道，本专利技术目的在于为樱桃植原体病害提供一种快速，灵敏，简便的田间检测方法，为樱桃植原体的早期诊断和检测提供技术支撑。
[0006]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案来实现。本专利技术首先根据樱桃植原体16SrDNA基因的保守序列，设计了樱桃植原体LAMP引物对，然后确定反应条件和各试剂浓度的优化，最后建立了樱桃植原体的LAMP快速检测体系，该方法在1h即可得到检测结果，具有高效、快速、简便、结果可视化的特点。
[0007]1、本专利技术建立的樱桃植原体的LAMP检测方法，步骤如下：（1）设计了一套用于检测樱桃植原体的LAMP引物对，引物序列所示：
F3:5
’‑
CATGCAAGTCGAACGGA
‑3’
B3:5
’‑
CTTAACCCCAATCATCGAC
‑3’
FIP:5
’‑
GCGTACGTACTACTCAGGCGGAGTACTAAGTGTCGGGGCAAC
‑3’
BI3:5
’‑
CCGCACAAGCGGTGGATCATAGCTTCGCAGAGTATGTCAA
‑3’
（2）提供的樱桃植原体的LAMP检测方法，首先从待测样品中制备总DNA模板，并配置LAMP反应体系，然后通过LAMP反应体系对模板进行扩增。
[0008]（3）通过肉眼观察反应管中颜色变化或是通过琼脂糖凝胶电泳检测样品是否有植原体病害的存在。
[0009]2、本专利技术提供了一种樱桃植原体的检测方法，具体的步骤包括如下：（1）设计一套用于樱桃植原体的LAMP引物，其设计方法为：在Genbank中搜集不同组的植原体16SrDNA基因核苷酸序列，利用DNAMan软件对上述序列进行比对、分析一致性，找出樱桃植原体与其他植原体的基因位点差异和高度保守区域，利用LAMP的引物在线软件Primer Explorer V5针对樱桃植原体16SrDNA基因保守序列的6个区域设计出1套特异性引物，分别为1对YT
‑
F3、YT
‑
B3外侧引物和1对YT
‑
FIP、YT
‑
BIP内侧引物，引物在上海生物工程公司合成。引物序列如下所示：F3:5
’‑
CATGCAAGTCGAACGGA
‑3’
B3:5
’‑
CTTAACCCCAATCATCGAC
‑3’
FIP:5
’‑
GCGTACGTACTACTCAGGCGGAGTACTAAGTGTCGGGGCAAC
‑3’
BI3:5
’‑
CCGCACAAGCGGTGGATCATAGCTTCGCAGAGTATGTCAA
‑3’
（2）植物总DNA的制备，其方法是：根据植物基因组提取试剂盒具体步骤提取樱桃叶片的总DNA，放置于
‑
20℃冰箱中备用。
[0010]（3）配置25
µ
L的LAMP反应体系：8 U/
µ
L Bst2 .0聚合酶为1.0
ꢀµ
L；10xIsothermalAmplificationBuffer缓冲液为2.5
ꢀµ
L；10 mM dNTPs为3.5
ꢀµ
L ；100 mM MgSO4为1.0
ꢀµ
L；20
ꢀµ
M内引物2.0
ꢀµ
L；10
ꢀµ
M外引物0.5
ꢀµ
L；模板DNA 1.0
ꢀµ
L;补足无菌超纯水至25
µ
L。
[0011]（4）利用LAMP反应程序对模板进行扩增：将配置好的所有组分的混合物放置在恒温60℃的水浴锅中反应60 min，80℃灭活5 min。
[0012]（5）LAMP检测结果的判断方法分析方法1：通过肉眼观察反应管中的颜色变化。如果反应管中扩增产物颜色变为翠绿色则判定为阳性，及样品有植原体的存在，若扩增产物颜色仍为橙色则为阴性分析方法2：。反应产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳25分钟，凝胶成像系统拍摄观察。如果出现梯形条带，则为阳性，即表明样品感染植原体，反之则为阴性，表明无植原体感染。
[0013]本专利技术有益效果（1）灵敏度高：对樱桃花变绿植原体检测的灵敏度比普通的PCR方法高100倍以上。
[0014]（2）检测的高效性：从DNA的提取，到检测完成所用时间约2小时，而常规PCR需4小时以上。
[0015]（3）经济实用、操本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种玛瑙红樱桃植原体环介导等温扩增检测方法，其方法的特征具体包括如下：提供2对用于检测樱桃植原体的LAMP引物序列，长度分别为：17 bp、19bp、42bp和40bp寡聚核苷酸序列，分别命名为YT
‑
F3/YT
‑
B3、YT
‑
FIP/YT
‑
BIP；（1）所得的两对LAMP引物的序列如下：YT
‑
F3：5
’‑
CATGCAAGTCGAACGGA
‑3’
YT
‑
B3：5
’‑
CTTAACCCCAATCATCGAC
‑3’
YT
‑
FIP：5
’‑
GCGTACGTACTACTCAGGCGGAGTACTAAGTGTCGGGGCAAC
‑3’
YT
‑
BIP：5
’‑
CCGCACAAGCGGTGGATCATAGCTTCGCAGAGTATGTCAA
‑3’
；提供的玛瑙红樱桃植原体LAMP检测方法，首先从待测样品中制备DNA模板，并配置LAMP反应体系，然后对模板DNA扩增，最后直接观测反应管中的颜色变化，或通过琼脂糖凝胶电泳检测，判断樱桃是否携带植原体病原菌。2.如权利要求1所述检测樱桃植原体的2对LAMP引物，其设计方法是：在Genbank中搜集不同组植原体16SrDNA基因核苷酸序列，利用DNAMan软件对上述序列比对分析一致性，找出樱桃植原体与其他植原体的基因位点差异和高度保守区域，利用LAMP引物在线软件Primer...

【专利技术属性】
技术研发人员：田文杰，文晓鹏，洪怡，黎霜，冉佳鑫，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：