新型溶瘤腺病毒载体、由其包装的病毒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种新型溶瘤腺病毒载体、由其包装的病毒及其应用。本发明专利技术揭示了一种新型腺病毒载体，并在该新型载体的基础上引入了一个或多个外源增强抑癌效果的基因(如溶瘤基因)，实现高效表达。同时，该复合型溶瘤腺病毒可以显著地抑制肿瘤，杀伤能力强。杀伤能力强。

【技术实现步骤摘要】
新型溶瘤腺病毒载体、由其包装的病毒及其应用


[0001]本专利技术属于病毒学和肿瘤学领域，更具体地，本专利技术涉及一种新型溶瘤腺病毒载体、由其包装的病毒及其应用。

技术介绍

[0002]溶瘤病毒是一类能在肿瘤细胞中特异性复制而不影响正常组织生存稳态的基因工程病毒，是继免疫检查点抑制剂之后的又一抗肿瘤生物疗法。以牛痘病毒、柯萨奇病毒、腺病毒、呼肠孤病毒、单纯疱疹病毒和麻疹病毒等病毒为载体构建的溶瘤病毒正在进行广泛的临床前及临床试验。其中的腺病毒载体是目前最具应用前景的疫苗载体之一，其具有高表达、可同时诱导特异性体液免疫和细胞免疫反应、安全性好、易于制备、无需佐剂等优点，被广泛应用于各种预防性或治疗性疫苗的研发如：埃博拉疫苗、寨卡疫苗、HIV疫苗、流感疫苗、疟疾疫苗、新型冠状病毒疫苗等。同时，在肿瘤基因治疗领域，腺病毒也常用作基因治疗及溶瘤疫苗构建，溶瘤腺病毒已成为最具发展前景的抗肿瘤免疫疗法之一。其中，应用最广泛的是人血清5型腺病毒(AdHu5)，然而，由于75
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80％的个体中存在抗AdHu5的预存中和抗体，以AdHu5为载体的疫苗，其免疫效果受预存中和抗体的影响，不仅削弱其免疫效果，而且可能增强副反应。为避免这一问题，研究者选择稀有血清型或其它种属来源的腺病毒作为疫苗载体。黑猩猩型腺病毒只流行于非洲的黑猩猩中，人群中一般不含抗黑猩猩型腺病毒的中和抗体，故基于黑猩猩型腺病毒载体的产品，其综合免疫效果优于AdHu5。
[0003]由于腺病毒基因组相对较大，一般的分子生物学方法难以完成重组腺病毒载体的构建，因此，腺病毒载体的构建依然是一个技术瓶颈。本专利技术人致力于此方面的研究，在以往的研究中已经进行了腺病毒载体的一些改良工作，然而进一步的、更符合本领域要求或临床所需的改造方案仍然是需要的。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种新型溶瘤腺病毒载体、由其包装的病毒及其应用。
[0005]在本专利技术的第一方面，提供一种制备溶瘤腺病毒载体的方法，包括基于黑猩猩型腺病毒AdC68基因组序列，改造其E1序列、E3序列和E4序列，所述改造包括：(1)在E1区保留E1A序列(删除其它序列)，利用肿瘤特异性启动子驱动E1A表达；(2)删除E3区序列(部分或全部)；和(3)改造E4序列，以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6和/或orf6/7替换其E4序列中orf6和/或orf6/7；可选地，还以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf4和/或orf3替换其E4序列中orf4和/或orf3；较佳地还删除其E4序列中orf1、orf2和/或orf3；其中，在E1区或E3区引入增强抑癌效果的基因(如溶瘤基因)的表达盒(如E1A后面或肿瘤特异性启动子之前)。
[0006]在本专利技术的另一方面，提供一种溶瘤腺病毒载体，包括以黑猩猩型腺病毒AdC68基因组为基础的序列，其中E1序列、E3序列、E4序列被改造，所述改造包括：(1)在E1区保留E1A序列(删除其它序列)，利用肿瘤特异性启动子驱动E1A表达；(2)删除E3区序列(部分或全
部)；和，(3)改造E4序列，以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6和/或orf6/7替换其E4序列中orf6和/或orf6/7；可选地，还以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf4和/或orf3替换其E4序列中orf4和/或orf3；较佳地还删除其E4序列中orf1、orf2和/或orf；其中，在E1区或E3区引入增强抑癌效果的基因(溶瘤基因)的表达盒。
[0007]在一个优选例中，所述C亚型人腺病毒包括(但不限于)：人血清5型腺病毒AdHu5，AdHu1，AdHu2，AdHu6；较佳地为AdHu5。
[0008]在另一优选例中，所述肿瘤特异性启动子包括选自(但不限于)：人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子，survivin启动子、环氧化酶(COX
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2)启动子，甲胎蛋白(AFP)启动子，E2F
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1启动子或Ki67启动子，或其组合。
[0009]在另一优选例中，所述的增强抑癌效果的基因包括(但不限于)编码选自下组因子的基因：CSF2，p53，TNF
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α，IL
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21，IL
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12，IL
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6，IL
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4，CD40L，PD
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L1单抗，或其组合；较佳地为CSF2，p53，或其组合。
[0010]在另一优选例中，(2)中，所述的增强抑癌效果的基因为2个或多个时，以连接序列进行操作性连接；较佳地，所述连接序列包括(但不限于)：F2A，P2A，T2A，IRES，GGGSGGGS。
[0011]在另一优选例中，(2)中，所述表达盒中，可选的还包括(但不限于)：以下可操作性相连的元件：信号肽编码序列、连接序列、终止子等。
[0012]在另一优选例中，所述重组腺病毒载体中，可选的还包括(但不限于)：报告基因的表达盒；反向末端重复序列；和/或酶切位点；较佳地包括：I
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CeuI，PI
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SceI，SwaI，PacI。
[0013]在另一优选例中，(1)中，E1序列的删除区域为E1B 19K和E1B 55K区域；较佳地为AdC68基因组第1444
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3403bp位。
[0014]在另一优选例中，(2)中，E3序列的删除区域为全部序列或选自orf2～orf8区域的至少2、3、4、5、6或7个orf序列(较佳地，以增强抑癌效果的基因的表达盒取代E3序列中全部序列或选自orf2～orf8区域的至少2、3、4、5、6或7个orf序列)；较佳地删除区域为orf2～orf8区域，更佳地该区域AdC68基因组第27446
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31423位。
[0015]在另一优选例中，(3)中，E4序列改造包括选自(但不限于)：(a)以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6/7和orf6替换其E4序列中orf6/7和orf6，删除其E4序列中orf1、orf2和orf3；(b)以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6、orf4和orf3替换其E4序列中orf6、orf4和orf3的序列，删除其E4序列中orf1、orf2、orf6/7；(c)以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6/7和orf6替换其E4序列中orf6/7和orf6的序列；或，(d)以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6、orf4替换其E4序列中orf6、orf4，删除其E4序列中orf1、orf2和orf3、orf6/7；较佳地，所述的重组腺病毒载体是SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的载体。
[0016]在另一优选例中，所述E3或E4的改造包括选自：
[0017](i)以增强抑癌效果的基因的表达盒取代E3序列中orf2～orf8；且以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6/7和orf6替换其E4序列中orf6/7和orf6，删除其E4序列中orf1、orf2和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备溶瘤腺病毒载体的方法，包括基于黑猩猩型腺病毒AdC68基因组序列，改造其E1序列、E3序列和E4序列，所述改造包括：(1)在E1区保留E1A序列，利用肿瘤特异性启动子驱动E1A表达；(2)删除E3区序列；和(3)改造E4序列，以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6和/或orf6/7替换其E4序列中orf6和/或orf6/7；可选地，还以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf4和/或orf3替换其E4序列中orf4和/或orf3；较佳地还删除其E4序列中orf1、orf2和/或orf3；其中，在E1区或E3区引入增强抑癌效果的基因的表达盒。2.一种溶瘤腺病毒载体，包括以黑猩猩型腺病毒AdC68基因组为基础的序列，其中E1序列、E3序列、E4序列被改造，所述改造包括：(1)在E1区保留E1A序列，利用肿瘤特异性启动子驱动E1A表达；(2)删除E3区序列；和(3)改造E4序列，以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6和/或orf6/7替换其E4序列中orf6和/或orf6/7；可选地，还以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf4和/或orf3替换其E4序列中orf4和/或orf3；较佳地还删除其E4序列中orf1、orf2和/或orf；其中，在E1区或E3区引入增强抑癌效果的基因的表达盒。3.如权利要求1所述的方法或权利要求2所述的重组腺病毒载体，其特征在于，(2)中，所述C亚型人腺病毒包括：人血清5型腺病毒AdHu5，AdHu1，AdHu2，AdHu6；较佳地为AdHu5。4.如权利要求1所述的方法或权利要求2所述的重组腺病毒载体，其特征在于，(1)中，所述肿瘤特异性启动子包括选自：人端粒酶逆转录酶启动子，survivin启动子、环氧化酶启动子，甲胎蛋白启动子，E2F
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1启动子或Ki67启动子，或其组合；或(2)中，所述的增强抑癌效果的基因包括编码选自下组因子的基因：CSF2，p53，TNF
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α，IL
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21，IL
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12，IL
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6，IL
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4，CD40L，PD
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L1单抗，或其组合；较佳地为CSF2，p53，或其组合。5.如权利要求1所述的方法或权利要求2所述的重组腺病毒载体，其特征在于，(1)中，E1序列的删除区域为E1B 19K和E1B 55K区域；较佳地为AdC68基因组第1444
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3403bp位；(2)中，E3序列的删除区域为全部序列或选自orf2～orf8区域的至少2、3、4、5、6或7个orf...

【专利技术属性】
技术研发人员：周东明，邢嫚，
申请(专利权)人：苏州相奕生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：