一种制备特定分子量范围动物源细胞外基质提取物的方法技术

本发明专利技术涉及一种制备细胞外基质提取物的方法(IPC分类号：A61L27/36)，尤其涉及一种制备特定分子量范围动物源细胞外基质提取物的方法。一种制备特定分子量范围动物源细胞外基质提取物的方法，其步骤包括：(1)前处理；(2)病毒灭活；(3)酶法脱细胞处理；(4)高温处理；(5)组织松解；(6)高速匀浆；(7)酶解；(8)精处理；(9)冷冻干燥成型；(10)射线辐射。通过本发明专利技术提供的方法制备的特定分子量多肽序列活性成分丰富，制备出富含III型胶原蛋白序列的超低分子量无菌复合多肽，代谢周期可控，活性维持时间久，且成本较低，可用于美容护肤、功能饮料及营养辅食的添加剂等。营养辅食的添加剂等。

【技术实现步骤摘要】
一种制备特定分子量范围动物源细胞外基质提取物的方法


[0001]本专利技术涉及一种制备细胞外基质提取物的方法(IPC分类号：A61L27/36)，尤其涉及一种制备特定分子量范围动物源细胞外基质提取物的方法。

技术介绍

[0002]胶原是大分子蛋白质，并不能直接被人体直接吸收，胶原多肽是胶原的水解产物，含有胶原蛋白全部的氨基酸，其良好的吸收性，溶解性，吸水性等是胶原不可比拟的。这些胶原多肽来源丰富，安全无毒，许多特医食品及化妆品中含有这些小分子多肽物质，具有调节体内活性酶、调抗氧化、抗癌、促进微量元素运输和吸收、促生长、改善食品风味和质构等特性。提取胶原多肽的方法主要有两种：化学法和酶法。化学法是用酸，碱等化学试剂在一定温度下促使胶原的肽链断裂成小分子的物质。但是化学法中的酸法会产生二次污染，碱法容易发生消旋现象，无生物利用价值，严重还会产生有毒的D型氨基酸，因此酶解法条件温和，时间短，无环境污染，产物理化性质稳定，作为胶原多肽的提取方法已成为发展趋势。
[0003]专利申请CN201310041670.3公开了一种生物活性胶原提取方法，此专利技术结合酸法和酶法两种胶原提取的方法，不仅克服了酸法产率低，又克服了酶法水解不彻底的缺点，但是此申请的工艺步骤均不超过13℃，加大了操作的难度。
[0004]因此，本专利技术提供了一种制备动物源细胞外基质提取物的方法，采用酶解法，制备出富含胶原蛋白序列的超低分子量无菌复合多肽的细胞外基质提取物。通过本专利技术制备细胞外基质提取物为低分子量多肽，与皮肤亲和性好，能渗入皮肤表皮层，进入真皮层，从而为皮肤提供了美白、抗皱、修复所需的生物活性成分。此外，所选的天然动物源组织原料成分包含I型胶原蛋白、III型胶原蛋白及IV型胶原蛋白等，通过本专利技术提供的方法制备的低分子量多肽序列活性成分丰富，代谢周期长，活性维持时间久，且成本较低，可用于美容护肤、功能饮料及营养辅食的添加剂等。

技术实现思路

[0005]为了解决上述问题，本专利技术的第一方面提供了一种制备特定分子量范围动物源细胞外基质提取物的方法，其步骤主要包括:
[0006](1)前处理：将动物源性组织清洗、分割成一定形状；
[0007](2)病毒灭活：将上述组织进行病毒灭活，分别用PBS溶液(磷酸盐缓冲溶液)，纯化水清洗数次；
[0008](3)酶法脱细胞处理：将上述组织用蛋白酶进行脱细胞处理，在20～85kHz的超声波功率下，使用超声波清洗剂作为辅助，进行超声波清洗，然后分别用PBS溶液，纯化水清洗数次；
[0009](4)高温处理：将上述脱细胞后的组织样品在80～120℃进行高温处理；
[0010](5)组织松解：将上述处理过的组织进行组织松解，得到组织纤维；
[0011](6)高速匀浆：将上述组织纤维与溶液按一定比例混合，在8000～25000rad/min
下，高速搅拌匀浆10～60min，得到浆液；
[0012](7)酶解：将上述的浆液，按一定比例加入蛋白酶，酶解一定时间，得到酶解液；
[0013](8)精处理：将上述酶解液在80～120℃下加热处理20
‑
40min，冷却后离心、收集上清液，采用透析膜获得精制液；
[0014](9)冷冻干燥成型：将上述的精制液通过冷冻干燥得粉末半成品；
[0015](10)射线辐射：将上述粉末半成品通过射线辐照处理，得到动物源细胞外基质提取物。
[0016]优选的，步骤(1)中所述动物源性组织为猪、牛、羊等陆地哺乳动物的真皮基质、膀胱粘膜下层基质、小肠粘膜下层基质、胃粘膜下层、心包膜、羊膜、胎盘、腹膜基质、基底膜基质、固有层基质、跟腱和鼠尾中的一种或多种。
[0017]进一步优选的，所述动物源性组织为猪小肠粘膜下层基质。
[0018]优选的，所述步骤(2)中病毒灭活方法为物理法病毒灭活，化学法病毒灭活的一种或多种。
[0019]进一步优选的，所述物理法病毒灭活为高温法病毒灭活。
[0020]进一步优选的，所述高温法病毒灭活具体为将上述组织在80～120℃下灭活30
‑
120min。
[0021]优选的，所述化学法病毒灭活具体为在过氧乙酸
‑
乙醇溶液或过氧化氢水溶液浸泡60～180min。
[0022]进一步优选的，所述化学法病毒灭活具体为在过氧乙酸
‑
乙醇溶液或过氧化氢水溶液浸泡120min。
[0023]优选的，所述过氧乙酸
‑
乙醇溶液的质量浓度为0.2％～5％。
[0024]进一步优选的，所述过氧乙酸
‑
乙醇溶液的质量浓度为2％。
[0025]进一步优选的，所述步骤(2)中病毒灭活方法为化学法病毒灭活。
[0026]优选的，步骤(3)中所述蛋白酶为胰蛋白酶、DNA酶。
[0027]进一步优选的，步骤(3)中所述蛋白酶为胰蛋白酶。所述胰蛋白酶占加入时总溶液的质量百分比为0.2％
‑
3％。
[0028]优选的，步骤(5)所述组织松解为对组织进行冷冻，再在液氮保护条件下进行液氮冷冻粉碎获得组织短纤维。
[0029]进一步优选的，步骤(5)所述组织松解为液氮冷冻粉碎。所述液氮冷冻粉碎转速1000rad/min～10000rad/min，液氮保护粉碎全过程。
[0030]进一步优选的，所述液氮冷冻粉碎，转速2000～5000rad/min。
[0031]优选的，步骤(6)所述溶液为纯化水，醋酸溶液，盐酸溶液，氢氧化钠溶液，氢氧化钾溶液的一种或多种。
[0032]进一步优选的，步骤(6)所述溶液为纯化水。
[0033]本专利技术所述纯化水，是指纯水通过蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其他适宜的方法制得的供药用的水，不含任何添加剂。
[0034]优选的，步骤(6)所述组织短纤维和纯化水的质量比为(1～20)：100。
[0035]进一步优选的，步骤(6)所述组织短纤维和纯化水的质量比为1：10。
[0036]进一步优选的，步骤(7)所述浆液与加入酶重量比为(90～110)：(0.5～4)。
[0037]优选的，步骤(7)所述蛋白酶为酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶的一种或多种。
[0038]优选的，所述酸性蛋白酶为胃蛋白酶、木瓜蛋白酶的一种或多种。
[0039]进一步优选的，所述酸性蛋白酶为胃蛋白酶，所述胃蛋白酶的质量浓度为0.2％
‑
3％。
[0040]优选的，所述碱性蛋白酶为牛胰蛋白酶，链霉菌蛋白酶，碱性芽孢杆菌蛋白酶的一种或多种。
[0041]进一步优选的，所述碱性蛋白酶为碱性芽孢杆菌蛋白酶，所述碱性芽孢杆菌蛋白酶为碱性芽孢杆菌蛋白酶地衣芽孢杆菌2709，其质量浓度为0.2～3％。
[0042]优选的，所述中性蛋白酶为中性芽孢杆菌蛋白酶，其质量浓度为0.2～3％。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备特定分子量范围动物源细胞外基质提取物的方法，其特征在于，其步骤主要包括:(1)前处理：将动物源性组织清洗、分割成一定形状；(2)病毒灭活：将上述组织进行病毒灭活，分别用PBS溶液，纯化水清洗数次；(3)酶法脱细胞处理：将上述组织用蛋白酶进行脱细胞处理，在20～85kHz的超声波功率下，使用超声波清洗剂作为辅助，进行超声波清洗，然后分别用PBS溶液，纯化水清洗数次；(4)高温处理：将上述脱细胞后的组织样品在80～120℃进行高温处理；(5)组织松解：将上述处理过的组织进行组织松解，得到组织短纤维；(6)高速匀浆：将上述组织短纤维与溶液按一定比例混合，在8000～25000rad/min下，高速搅拌匀浆10～60min，得到浆液；(7)酶解：将上述的浆液，按一定比例加入蛋白酶，酶解一定时间，得到酶解液；(8)精处理：将上述酶解液在80～120℃下加热处理20
‑
40min，冷却后离心、收集上清液，采用透析膜获得精制液；(9)冷冻干燥成型：将上述的精制液通过冷冻干燥得粉末半成品；(10)射线辐射：将上述粉末半成品通过射线辐照处理，得到动物源细胞外基质提取物。2.根据权利要求1所述的制备特定分子量范围动物源细胞外基质提取物的方法，其特征在于，步骤(2)中所述病毒灭活的方法为物理法病毒灭活，化学法病毒灭活的一种或多种。3.根据权利要求2所述的制备特定分子量范围动物源细胞外基质提取物的方法，其特征在于，所述化学法病毒灭活具体...

【专利技术属性】
技术研发人员：莫亚琴，曾德文，
申请(专利权)人：上海中匡生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：