本发明专利技术公开了重组酿酒酵母的构建方法、相关生物材料及其应用。该构建方法包括将重组融合蛋白的编码基因导入出发微生物，得到重组微生物；所述重组融合蛋白含有Pln1蛋白和萜合成相关蛋白。该构建方法通过Pln1蛋白对三萜生物合成路径中的部分关键酶进行重新定位，以促使酶从空间上接近底物，促进储存在脂滴中的天然产物脂溶性中间体的转化。产物脂溶性中间体的转化。
【技术实现步骤摘要】
重组微生物的构建方法、相关生物材料及其应用
[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及重组微生物的构建方法、相关生物材料及其应用。
技术介绍
[0002]天然化合物及其衍生物在药疗、保健方面有着重要的应用，伴随着越来越多的天然化合物分子的药理作用得到表征，其市场需求量也在日益增多。而传统的植物提取法或化学合成法都存在着诸多局限性。植物提取造成植物资源的极大浪费且获得的活性成分极低。化学合成一方面带来环境压力，另一方面在处理结构复杂的天然化合物时存在合成路线长、产率低等问题。合成生物学是近年来兴起的对生命系统和过程进行重新设计和工程化构建与应用的科学，为天然化合物的规模化生产及新结构的小分子化合物的设计与合成提供了强有力的技术和平台支撑。近年来也不断有利用合成生物学方法制备其他活性植物天然产物的报道，涉及的天然产物包括萜类、黄酮类、多酚类、生物碱等，这些新技术形成的绿色、高效的生产链正在被科学及工业界认可。
[0003]萜类是一类具有多种功能且应用广泛的最大疏水性物质之一，可用作香料和香精，药物，溶剂，化妆品，食品添加剂和潜在的高级生物燃料。酵母由于其遗传背景清晰遗传操作简单等特点而被认为是生产类异戊二烯的理想宿主。然而，真核细胞被分为几个亚细胞器，它们具有复杂的结构，具有自己的膜。特别地，细胞代谢被划分成专门的亚细胞器。例如，氧化磷酸化发生在线粒体中，脂肪酸的β
‑
氧化位于过氧化物酶体中，这导致辅因子和前体的分散。这种亚细胞区室化可能在供应前体和辅因子时给底物通道带来一些障碍。利用酿酒酵母异源合成萜类天然产物所面临的问题之一是其脂溶性中间体大部分存储在酵母细胞的亚细胞空间——脂滴内部。
[0004]尽管已经进行了广泛的代谢工程，但是酵母中大多数类异戊二烯的生产仍远远落后于工业应用，这可能部分归因于复杂的代谢区室化。因此，对细胞亚室和利用亚细胞器的系统研究可能为进一步增强酵母甚至其他真核细胞中类异戊二烯的生物合成提供一种可行的方法。
技术实现思路
[0005]本专利技术提供构建重组微生物的方法，包括将重组融合蛋白的编码基因导入出发微生物，得到重组微生物；所述重组融合蛋白含有Pln1蛋白和萜合成相关蛋白。
[0006]可选地，根据上述的方法，所述萜合成相关蛋白选自原人参二醇合酶PPDS01和/或细胞色素P450还原酶ATR1。
[0007]所述萜合成相关蛋白可包括PPDS01和ATR1，则PPDS01和ATR1可经连接肽连接。ATR1可为N端截短46个氨基酸的细胞色素P450还原酶46tATR1，例如46tATR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2中第780位
‑
第1425位所示。
[0008]可选地，根据上述的方法，所述重组融合蛋白中，所述Pln1蛋白和所述萜合成相关
蛋白经连接肽连接。
[0009]上文中，所述连接肽可为GGGS或GSTSSG。
[0010]可选地，根据上述的方法，所述重组融合蛋白为含有所述Pln1蛋白、PPDS01和ATR1的重组蛋白。
[0011]可选地，根据上述的方法，所述Pln1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2中第1位
‑
第283位所示；所述PPDS01的氨基酸序列如SEQ ID No.2中第288位
‑
第773位所示；所述ATR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2中第780位
‑
第1425位所示。
[0012]可选地，根据上述的方法，所述重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2中的所示。在SEQ ID No.2中，第1位
‑
第283位为Pln1蛋白的氨基酸序列，第284位
‑
第287位为连接肽GGGS的氨基酸序列，第288位
‑
第773位为PPDS01的氨基酸序列，第774位
‑
第779位为连接肽GSTSSG的氨基酸序列，第780位
‑
第1425位为ATR1的氨基酸序列。
[0013]该方法还可包括使上述重组融合蛋白的编码基因得到表达。该编码基因具体序列可如SEQ ID No.1中第431位
‑
第4708位所示。
[0014]可选地，根据上述的方法，所述重组微生物中，所述重组融合蛋白的编码基因整合入所述出发微生物的YPL062W位点。
[0015]可选地，根据上述的方法，所述重组融合蛋白的编码基因通过表达所述重组融合蛋白的表达盒导入所述出发微生物，获得所述重组微生物。表达所述重组融合蛋白的表达盒序列可如SEQ ID No.1所示，其中启动子P
TEF1
为第1
‑
430位，Pln1蛋白的编码基因为第431
‑
1279位，连接肽GGGS的编码基因为第1280
‑
1291位，蛋白PPDS01的编码基因为第1292
‑
2749位，连接肽GSTSSG的编码基因为第2750
‑
2767位，蛋白46tATR1的编码基因为第2768
‑
4708位，终止子T
CYC1
为第4709
‑
5015位。
[0016]可选地，根据上述的方法，所述出发微生物为酿酒酵母，所述酿酒酵母为对菌株BYT1进行如下A1
‑
A12改造得到的菌株，
[0017]A1、导入3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1基因；A2、导入甲羟戊酸激酶基因ERG12基因；A3、导入乙醇脱氢酶I基因IDI1基因；A4、导入焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因ERG19基因；A5、导入羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因HMGR基因；A6、导入羟甲基戊二酰
‑
辅酶A合成酶基因ERG13基因；A7、导入磷酸甲戊酸激酶基因ERG8基因；A8、导入乙酰辅酶A乙酰转移酶基因ERG10基因；A9、导入角鲨烯合酶基因AtSQS2基因；A10、导入角鲨烯单加氧酶基因ERG1基因；A11、导入法尼基焦磷酸合成酶基因SmFPS基因；A12、导入达玛烯二醇合酶基因spgDDS基因。
[0018]可选地，所述tHMG1基因编码的tHMG1蛋白质的序列为genbank登陆号：AJS96703.1的第530
‑
1054位所示；所述ERG12基因编码的ERG12蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_013935.1所示；所述IDI1基因编码的IDI1蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_015208.1所示；所述ERG19基因编码的ERG19蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_014441.1所示；所述HMGR基因编码的HMGR蛋白质的序列为genbank登陆号：WP_011241944.1所示；所述ERG13基因编码的ERG13蛋白质的序列为genbank登陆号：NP_013580.1所示；所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.构建重组微生物的方法，其特征在于：包括将重组融合蛋白的编码基因导入出发微生物，得到重组微生物；所述重组融合蛋白含有Pln1蛋白和萜合成相关蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述萜合成相关蛋白选自原人参二醇合酶PPDS01和/或细胞色素P450还原酶ATR1。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述重组融合蛋白中，所述Pln1蛋白和所述萜合成相关蛋白经连接肽连接。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，其特征在于：所述重组融合蛋白为含有所述Pln1蛋白、PPDS01和ATR1的重组蛋白。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述Pln1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2中第1位
‑
第283位所示；所述PPDS01的氨基酸序列如SEQ ID No.2中第288位
‑
第773位所示；所述ATR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2中第780位
‑
第1425位所示。6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2中的所示。7.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的方法，其特征在于：所述重组微生物中，所述重组融合蛋白的编码基因整合入所述出发微生物的YJL062W位点。8.根据权利要求1
‑
7中任一项所述的方法，其特征在于：所述重组融合蛋白的编码基因通过表达所述重组融合蛋白的表达盒导入所述出发微生物，获得所述重组微生物。9.根据权利要求1
‑
8中任一项所述的方法，其特征在于：所述出发微生物为酿酒酵母，所述酿酒酵母为对菌株BYT1进行如下A1
‑
A12改造得到的菌株，A1、导入3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1基因；A2...
【专利技术属性】
技术研发人员：张学礼，戴住波，石玉松，王冬，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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