本发明专利技术提供了一种提高毕赤酵母中葡萄糖氧化酶(GOD)产量的基因及其应用。具体地，本发明专利技术提供了一种葡萄糖氧化酶(GOD)生产菌株的构建方法，在出发菌株中，增强囊泡促分泌因子的活性或导入囊泡促分泌因子。通过实验证实，共表达参与高尔基体到质膜囊泡运输途径的VAMP4基因，毕赤酵母的胞外GOD产量显著提高。毕赤酵母的胞外GOD产量显著提高。
【技术实现步骤摘要】
强化高尔基体至胞外蛋白运输过程提高毕赤酵母胞外葡萄糖氧化酶产量
[0001]本专利技术涉及生物
具体地，涉及一种强化高尔基体至胞外蛋白运输过程提高毕赤酵母胞外葡萄糖氧化酶产量。
技术介绍
[0002]葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD，EC 1.1.3.4)本质是一种黄素糖蛋白，作为一种同型二聚体分子，能够将β
‑
D葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，其中分子氧作为电子受体生成过氧化氢。近年来，GOD作为一种成熟的商品化工业用酶，越来越多地被用于食品、纺织漂染等行业、在葡萄糖生物传感器、环保燃料等新兴行业也均有着广泛的应用，但目前商品GOD的产量低成为了其在工业上的大规模应用的主要限制因素。
[0003]毕赤酵母表达系统作为一种外源蛋白表达系统，具有对表达蛋白可翻译后加工、外源蛋白易纯化、可高密度发酵、培养成本低等优势，因此毕赤酵母近年来被选作是GOD常用的表达宿主。但越来越多的研究证明，酵母分泌途径的障碍成为了实现外源蛋白高效表达的瓶颈之一，其中蛋白质从内质网到高尔基体，再从高尔基体到细胞质膜需要囊泡的运输，而囊泡运输效率不高会造成部分外源蛋白在胞内积累。
[0004]综上，本领域急需提供一种提高囊泡运输效率的方法，提高葡萄糖氧化酶产量。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的在于提供一种强化高尔基体至胞外蛋白运输过程提高毕赤酵母胞外葡萄糖氧化酶产量的方法。
[0006]在本专利技术的第一方面，提供了一种提高酵母细胞葡萄糖氧化酶(GOD)的表达和/或活性的方法，包括以下步骤：
[0007]在出发菌株中，增强酵母细胞的囊泡促分泌因子或其基因的表达和/或活性，从而获得酵母细胞葡萄糖氧化酶(GOD)的表达、和/或酵母细胞的葡萄糖氧化酶(GOD)活性提高的GOD生产菌株，其中，
[0008]所述囊泡促分泌因子包括一种或多种选自下组的蛋白：
[0009](1)具有如SEQ ID NO.:1
‑
6中任一所示的氨基酸序列的蛋白；
[0010](2)将如SEQ ID NO.:1
‑
6中任一所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有囊泡促分泌因子活性的由(1)衍生的蛋白；和/或
[0011](3)氨基酸序列与SEQ ID NO.:1
‑
6中任一所示序列的同源性≥85％(较佳地≥90％、95％、更佳地≥98％)，具有囊泡促分泌因子活性的蛋白。
[0012]在另一优选例中，所述囊泡促分泌因子包括将如SEQ ID NO.:1
‑
6中任一所示的氨基酸序列的两端添加1
‑
5个氨基酸残基而形成的，具有囊泡促分泌因子活性的由(1)衍生的蛋白。
[0013]在另一优选例中，所述囊泡促分泌因子至少包括具有如SEQ ID NO.:1所示的氨基
酸序列的蛋白。
[0014]在另一优选例中，所述囊泡促分泌因子包括至少2种(较佳地3种、4种、5种)具有如SEQ ID NO.:1
‑
6中任一所示的氨基酸序列的蛋白。
[0015]在另一优选例中，所述囊泡促分泌因子选自如SEQ ID NO.:1、2和/或5所示的氨基酸序列的蛋白中一种或多种。
[0016]在另一优选例中，所述的囊泡促分泌因子选自下组的一种或多种：VAMP4、SEC4、EXO84P、EXO70P、STX1
‑
4、YPT32；较佳地，选自VAMP4、SEC4、EXO84P。
[0017]在另一优选例中，所述的增强囊泡促分泌因子的活性包括：
[0018](1)提高囊泡促分泌因子的表达量和/或蛋白自身活性；和/或
[0019](2)减少囊泡促分泌因子的降解和/或失活。
[0020]在另一优选例中，所述提高囊泡促分泌因子的表达量包括：上调囊泡促分泌因子的编码基因的表达。
[0021]在另一优选例中，所述囊泡促分泌因子为外源性或内源性的。
[0022]在另一优选例中，所述囊泡促分泌因子为内源性的。
[0023]在另一优选例中，所述囊泡促分泌因子的编码基因选自下组：cDNA序列、基因组序列、或其组合。
[0024]在另一优选例中，所述上调囊泡促分泌因子的编码基因的表达包括上调所述编码基因的转录水平和/或翻译水平。
[0025]在另一优选例中，所述增强囊泡促分泌因子的活性可通过以下方法之一或组合实现：表达同源或异源的所述蛋白的编码基因，和/或增加所述菌株中所述编码基因的拷贝数，和/或改造所述编码基因的调控序列(如启动子)以增强转录速度(如转录启动速度)，和/或修改携带有所述编码基因的信使RNA的翻译调控区以增强翻译强度，和/或修改编码基因本身以增强mRNA稳定性、蛋白质稳定性、解除蛋白质的反馈抑制。
[0026]在另一优选例中，所述增强囊泡促分泌因子的活性包括在菌株中过表达所述囊泡促分泌因子。
[0027]在另一优选例中，与出发菌株相比，所述GOD生产菌株中的囊泡促分泌因子的含量和/或活性至少提高了20％，较佳地，至少提高了30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或200％。
[0028]在另一优选例中，与出发菌株相比，所述GOD生产菌株中的GOD的胞内外总酶含量(或产量)和/或活性至少提高了2％，较佳地，至少提高了5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或200％。
[0029]在另一优选例中，与出发菌株相比，所述GOD生产菌株中的GOD的胞外酶含量(或产量)和/或活性至少提高了3％，较佳地，至少提高了5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或200％.
[0030]在另一优选例中，与出发菌株相比，所述GOD生产菌株中的GOD的分泌率至少提高了5％，较佳地，至少提高了10％、20％、30％、40％、50％、60％、80％、90％或100％。
[0031]在另一优选例中，所述构建方法包括步骤：
[0032](a1)提供携带囊泡促分泌因子编码基因的表达载体；
[0033](b1)将所述的表达载体转入出发菌株中，得到重组菌株；和
[0034](c1)培养所述的重组菌株。
[0035]在另一优选例中，所述方法还包括测定所得菌株的GOD产量。
[0036]在另一优选例中，所述的出发菌株为酵母细胞。
[0037]在另一优选例中，所述酵母细胞选自毕赤酵母、酿酒酵母。
[0038]在另一优选例中，所述酵母细胞为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。
[0039]在另一优选例中，所述出发菌株为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。
[0040]在另一优选例中，所述出发菌株表达GOD野生型或其突变体。
[0041]在本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种提高酵母细胞葡萄糖氧化酶(GOD)的表达和/或活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：在出发菌株中，增强酵母细胞的囊泡促分泌因子或其基因的表达和/或活性，从而获得酵母细胞葡萄糖氧化酶(GOD)的表达、和/或酵母细胞的葡萄糖氧化酶(GOD)活性提高的GOD生产菌株，其中，所述囊泡促分泌因子包括一种或多种选自下组的蛋白：(1)具有如SEQ ID NO.:1
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6中任一所示的氨基酸序列的蛋白；(2)将如SEQ ID NO.:1
‑
6中任一所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有囊泡促分泌因子活性的由(1)衍生的蛋白；和/或(3)氨基酸序列与SEQ ID NO.:1
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6中任一所示序列的同源性≥85％(较佳地≥90％、95％、更佳地≥98％)，具有囊泡促分泌因子活性的蛋白。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述囊泡促分泌因子选自如SEQ ID NO.:1、2和/或5所示的氨基酸序列的蛋白中一种或多种。3.一种GOD生产菌株，其特征在于，所述菌株中囊泡促分泌因子的活性增强，其中，所述囊泡促分泌因子包括一种或多种选自下组的蛋白：(1)具有如SEQ ID NO.:1
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6中任一所示的氨基酸序列的蛋白；(2)将如SEQ ID NO.:1
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6中任一所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有囊泡促分泌因子活性的由(1)衍生的蛋白；和/或(3)氨基酸序列与SEQ ID NO.:1
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6中任一所示序列的同源性≥85％(较佳地≥90％、95％、更佳地≥98％)，具有囊泡促分泌因子活性的蛋白。4.一种制备GOD蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：1)发酵培养如权利要求3所述的GOD生产菌株，从而得到GOD蛋白；和2)任选从1)的发酵培养体系中获得GOD蛋白。5.一种增强菌株GOD蛋白生产能力的方法，其特征在于，包括步骤：在出发菌株中，增强囊泡促分泌因子的活性，其中，所述囊泡促分泌因子包括一种或多种选自下组的蛋白：(1)具有如SEQ ID NO.:1
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6中任...
【专利技术属性】
技术研发人员：钱江潮，张梦蕾，周虎志，王泽建，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：
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