一种芋螺毒素突变体及其制备方法和应用技术

本方法公开了一种芋螺毒素突变体，所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:1GCCX1X2X3ACX4X5X6X7X8X9X

【技术实现步骤摘要】
一种芋螺毒素突变体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及一系列对α9α10乙酰胆碱受体具有强烈抑制作用的芋螺毒素突变体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]乙酰胆碱受体是位于细胞膜上，由不同亚基组成的五聚体离子通道蛋白，其可以调控神经肌肉接头以及中枢和外周神经系统之间的突触传递。根据组成其受体亚基的不同，可将其分为α9α10乙酰胆碱受体(α9α10 nAChR)，α7 nAChR和α3β2 nAChR等神经性乙酰胆碱受体以及α1β1γδ等肌肉型乙酰胆碱受体。乙酰胆碱受体结构和功能的异常与一系列的病理生理过程密切相关，且α9α10 nAChR是近年来新发现的用于治疗疼痛的靶标。对α9α10 nAChR具有抑制作用的分子具有潜在的镇痛活性。另外，α9α10 nAChR被发现在肿瘤细胞中过量表达，α9α10 nAChR也被认为是肿瘤药物研究的靶点(Pharmacol Ther.2020 Dec 10；222:107792.)。选择性靶向α9α10 nAChR的芋螺也有被开发为抗肿瘤药物的潜力。
[0003]芋螺毒素(Conotoxin,CTX)是由生活在热带海洋中的肉食性软体动物芋螺(Conus)分泌出来的，用于麻醉猎物的小肽类毒素，常为一些由10
‑
40个氨基酸组成的，富含二硫键的短肽，并具有许多的药理活性。其主要以膜蛋白为靶标，尤其是离子通道受体，膜受体和转运蛋白等。根据其药理活性和分子靶标的不同，可将芋螺毒素分为α，μ等许多不同的家族。其中的α
‑
芋螺毒素(α
‑
CTxs)能够特异性的作用于乙酰胆碱受体，发挥抑制作用。α
‑
CTxs通常为一些由12
‑
19个氨基酸组成的含有两对二硫键的短肽，且其二硫键为CysⅠ‑
CysⅢ，CysⅡ‑
CysⅣ的连接方式。Mr1.1是通过PCR对Conus marmoreus的毒液管的cDNA序列进行扩增而得到的新的α
‑
4/7芋螺毒素。Can Peng.et.al.的研究表明，Mr1.1可在体外特异性作用于老鼠α7 nAChR，并能够在1μmol水平抑制40％乙酰胆碱引起的α6α3β2 nAChR的电流强度，其在体内实验中也显示出有镇痛活性。

技术实现思路

[0004]本专利技术在深入研究α
‑
芋螺毒素时发现，对Mr1.1氨基酸残基进行特定的突变可以具有针对α9α10 nAChR的特异性，并且显示出显著的镇痛活性。
[0005]本专利技术所述的技术问题可通过以下技术方案得以解决：
[0006]一种芋螺毒素突变体，所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:1GCCX1X2X3ACX4X5X6X7X8X9X
10
C X
11
；
[0007]其中，X1选自S、T、A、R、(S)
‑2‑
氨基
‑3‑
胍基丙酸(Alg)、L
‑
2,3
‑
二氨基丙酸(Dap)或L
‑
2,4
‑
二氨基丁酸(Dab)中的任一种；X2选自H、R、W、A或N；X3选自P或Hyp中的任一种；X4选自S、L、V、A、D、K、T、Dab、Dap或Y中的任一种；X5选自V、L、A、Y、R、Cit、Dap、Dab、D或K中的任一种；X6选自N，Q或A中的任一种；X7选自N，H或A中的任一种；X8为P或A；X9选自D，E，S或A中的任一种；X
10
为I或A；X
11
为C端酰基化，或者，选自Y、L或R中的任一种。
[0008]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:
2GCCSHPACSVNNPDICX
11
；其中，X
11
选自Y、L或R中的任一种。
[0009]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述突变体氨基酸序列的N端甲基化或乙酰化。
[0010]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:3GCCSHPACSVNNPDIC*(*代表C端酰胺化)，或者，SEQ ID NO:4GCC(Dap)HPACSVNNPDIC*(*代表C端酰胺化)。
[0011]在根据本专利技术的一个实施方案中，其特征在于，所述突变体中第2位与第8位的半胱氨酸形成链内二硫键，第3位和第16位的半胱氨酸形成链内二硫键。
[0012]本专利技术进一步提供了上述芋螺毒素突变体的制备方法，包括：
[0013]1)将树脂用二氯甲烷、N，N
‑
二甲基甲酰胺进行活化，后按照固相合成方法得到直链肽SEQ ID NO:1；
[0014]2)使用三氟乙酸、水、苯酚和三异丙基硅烷的混合溶液对树脂进行切割，旋蒸除去三氟乙酸，然后加入冰乙醚，至析出白色固体；离心将所述白色固体以水溶解为重溶液，然后将所述重溶液冻干，得到固体粉末；
[0015]3)以第一巯基保护基保护序列SEQ ID NO:1中第2位、每8位的半胱氨酸的巯基；以第二巯基保护基保护序列SEQ ID NO:1中第3位和16位的半胱氨酸；
[0016]4)各自按照针对第一巯基保护基和第二巯基保护基的二硫键构建方法分别构建第2位
‑
第8位、第3位
‑
第16位的二硫键。
[0017]在根据本专利技术的一个实施方案中，步骤1)中对树脂进行活化时二氯甲烷、N，N
‑
二甲基甲酰胺的体积比为1：1。
[0018]在根据本专利技术的一个实施方案中，步骤2)中三氟乙酸、水、苯酚、三异丙基硅烷的体积比为80：3
–
7：3
–
7：1
–
5。
[0019]在根据本专利技术的一个实施方案中，步骤3)中第一巯基保护基和第二巯基保护基分别为三苯甲基或乙酰胺甲基，且第一巯基保护基和第二巯基保护基不相同；
[0020]优选地，当第一巯基保护基或第二巯基保护基为三苯甲基时，采用空气氧化法，构建二硫键；进一步优选地，所述空气氧化法是通过包括下述步骤的方法实现的：将固体粉末以0.2mg/mL的浓度溶解于0.2M碳酸氢铵水溶液中，于室温条件下搅拌反应48h，反应后冻干即得；
[0021]当第一巯基保护基或第二巯基保护基为乙酰胺甲基时，通过包括下述步骤的方法构建二硫：
[0022]将水、乙腈和TFA以体积比5：5：0.01混合配制反应溶剂，称取适量白色固体粉末溶于反应溶剂中，然后加入1
–
5mg/mL碘/乙腈溶液,混合溶液中多肽浓度为(1
–
3mg/mL)，混匀，使溶液呈无色澄清，冻干即得；进一步优选地，碘/乙腈溶液为2.5mg/mL，抗坏血酸水溶液5mg/mL。
[0023]本专利技术进一步提供了上述芋螺毒素突变体在制备α9α10 nAChR抑制本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种芋螺毒素突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:1GCCX1X2X3ACX4X5X6X7X8X9X
10
C X
11
；其中，X1选自S、T、A、R、(S)
‑2‑
氨基
‑3‑
胍基丙酸(Alg)、L
‑
2,3
‑
二氨基丙酸(Dap)或L
‑
2,4
‑
二氨基丁酸(Dab)中的任一种；X2选自H、R、W、A或N；X3选自P或Hyp中的任一种；X4选自S、L、V、A、D、K、T、Dab、Dap或Y中的任一种；X5选自V、L、A、Y、R、Cit、Dap、Dab、D或K中的任一种；X6选自N，Q或A中的任一种；X7选自N，H或A中的任一种；X8为P或A；X9选自D，E，S或A中的任一种；X
10
为I或A；X
11
为C端酰胺化，或者，选自Y、L或R中的任一种。2.如权利要求1所述的芋螺毒素突变体，其特征在于，所述突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:2GCCSHPACSVNNPDICX
11
；其中，X
11
选自Y、L或R中的任一种。3.如权利要求1所述的芋螺毒素突变体，其特征在于，所述突变体氨基酸序列的N端甲基化或乙酰化；优选地，所述突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:3GCCSHPACSVNNPDIC，且C端酰胺化；或者SEQ ID NO:4GCC(Dap)HPACSVNNPDIC，且C端酰胺化。4.如权利要求1
‑
3中任一项所述的芋螺毒素突变体，其特征在于，所述突变体中第2位与第8位的半胱氨酸形成链内二硫键，第3位和第16位的半胱氨酸形成链内二硫键。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的芋螺毒素突变体的制备方法，其特征在于，包括：1)将树脂用二氯甲烷、N，N
‑
二甲基甲酰胺进行活化，后按照固相合成方法得到直链肽SEQ ID NO:1；2)使用三氟乙酸、水、苯酚和三异丙基硅烷的混合溶液对树脂进行切割，旋蒸除去三氟乙酸，然后加入冰乙醚，至析出白色固体；离心将所述白色固体以水溶解为重溶液，然后将所述重溶液冻干，得到固体粉末；3)以第一巯基保护基保护序列SEQ ID NO:1中第2位、第8位的半胱氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：于日磊，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：