一种基于磁珠的均一化建库试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种基于磁珠的均一化建库试剂盒和方法，属于测序技术领域。所述多对引物对，各引物对的上游引物和下游引物中至少一个连接有生物素分子，并且上游引物和下游引物中至少一个具有样本标记序列，各引物对的样本标记序列不同。所述方法包括利用各引物分别对不同样本来源的DNA样本进行PCR扩增，获得多个PCR扩增产物；利用等量的链霉亲和素磁珠分别与获得的多个PCR扩增混合，得到多个磁珠

【技术实现步骤摘要】
一种基于磁珠的均一化建库试剂盒和方法


[0001]本专利技术属于寡核苷酸建库
，具体地，涉及一种基于磁珠的均一化建库试剂盒和方法。

技术介绍

[0002]文库均一化混合，是指将多个不同样本的DNA文库，按照DNA分子摩尔比例混合每个样本，以平衡每个文库的上机测序数据。目前的常用上机测序过程是：构建完成的DNA文库，先经过DNA浓度测定、qPCR测定DNA文库摩尔浓度、Bioanalyzer分析DNA分子片段大小等检测后，确定文库的分子摩尔量；根据不同文库预期获取的测序数据量，准确混合每个样品的DNA摩尔比例。该方法需要较长的检测过程，较多的人工操作，比较繁琐。
[0003]目前利用磁珠混样处理DNA测序文库的方法，例如对构建完成的文库双链DNA末端进行消化，产生黏性末端特异性结合带有磁珠的DNA结合片段，利用固定数量的磁珠捕获DNA分子，但该方法需要使用多种工具酶，成本较高。或者利用一定分子数的5'修饰生物素的捕获探针来均一化DNA分子数，这需要额外引入捕获探针，并计算其分子数，操作繁琐。或者通过扩增过程引入生物素修饰的dNTP，利用链霉亲和素磁珠捕获携带生物素分子的扩增产物，但不同样本的高度变异区扩增子携带的生物素分子数难以确定，相同用量的链霉亲和素磁珠捕获不同文库的产量可能有所差异。
[0004]目前常用的引物生物素修饰是利用C6或是TEG间臂被添加在寡核苷酸的5'末端，生物素TEG需要纯化，中间的生物素修饰可以通过dT碱基加入，这种形式需要更多的纯化步骤。
[0005]因此，目前仍然缺少高效的均一化建库方法，无法满足高通量测序的要求。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题中的至少一个，本专利技术采取的技术方案如下：
[0007]本专利技术第一方面提供一种基于磁珠的均一化建库试剂盒，所述试剂盒包括多对引物对，各引物对的上游引物和下游引物中至少一个连接有生物素分子，并且上游引物和下游引物中至少一个具有样本标记序列，各引物对的样本标记序列不同。
[0008]在本专利技术的一些实施方案中，所述样本标记序列为至少6个随机合成序列。
[0009]在本专利技术的一些实施方案中，所述上游引物和下游引物还分别包括测序通用接头序列。
[0010]在本专利技术的一些优选实施方案中，所述上游引物5'
‑
3'依次为测序通用接头序列、第一样本标记序列和上游目标区域特异性序列；所述上游引物5'
‑
3'依次为测序通用接头序列、第二样本标记序列和下游目标区域特异性序列。
[0011]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述第一样本标记序列和所述第二样本标记序列不同，可以任意组合为上千种组合，同时兼容不同扩增需求的样本。
[0012]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述目标区域为细菌的16S rRNA的V3、V4区。进
一步地，所述上游目标区域特异性序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述下游目标区域特异性序列的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0013]在本专利技术的一些实施方案中，所述试剂盒还包括链霉素亲和磁珠。
[0014]在本专利技术的一些实施方案中，所述试剂盒还包括磁珠清洗液和/或磁珠结合液。
[0015]进一步地，所述磁珠清洗液的组分为：pH 7.5的Tris
‑
HCl 5mM，EDTA 0.5mM，NaCl 1M。
[0016]进一步地，所述磁珠结合液的组分为：pH 7.5的Tris
‑
HCl 40mM，EDTA 4mM，NaCl 4M。
[0017]本专利技术的第二方面提供利用本专利技术第一方面所述的试剂盒进行均一化建库的方法，包括以下步骤：
[0018]S1，利用权利要求1所述的各引物对分别对不同样本来源的DNA样本进行PCR扩增，获得多个PCR扩增产物；
[0019]S2，利用等量的链霉亲和素磁珠分别与步骤S1获得的多个PCR扩增产物混合，得到多个磁珠
‑
PCR产物混合液；
[0020]S3，将步骤S2获得的多个磁珠
‑
PCR产物混合液，用磁力架分离磁珠；
[0021]S4，对磁珠进行清洗；
[0022]S5，将磁珠清洗后，加入ddH2O混匀磁珠，65℃3～10分钟，用磁力架分离，取上清，即为均一化的测序文库。
[0023]在本专利技术的一些实施方案中，步骤S4中，具体步骤为：利用磁珠清洗液重悬磁珠，混合所有磁珠，用磁力架分离，并弃上清；磁珠结合液冲洗磁珠一次，用磁力架分离，并弃上清；用10mM Tris
‑
HCl冲洗磁珠一次，用磁力架分离，并弃上清；用ddH2O冲洗磁珠一次，用磁力架分离，并弃上清。
[0024]在本专利技术的一些实施方案中，所述磁珠清洗液的组分为：pH 7.5的Tris
‑
HCl 5mM，EDTA 0.5mM，NaCl 1M。
[0025]在本专利技术的一些实施方案中，所述磁珠结合液的组分为：pH 7.5的Tris
‑
HCl 40mM，EDTA 4mM，NaCl 4M。
[0026]进一步地，步骤S2中，所述链霉亲和素磁珠在与所述PCR扩增产物混合之前，还包括利用磁珠清洗液进行清洗的步骤。
[0027]在本专利技术的一些实施方案中，利用磁珠清洗液、磁珠结合液、10mM Tris
‑
HCl或ddH2O清洗两次或更多。
[0028]本专利技术第三方面提供利用本专利技术第二方面的方法得到的测序文库。
[0029]本专利技术的有益效果
[0030]相对于现有技术，本专利技术具有以下有益效果：
[0031]利用本专利技术的试剂盒和方法，能够方便、快捷地完成均一化混为，可实现自动化操作。
[0032]利用本专利技术的试剂盒和方法，无需对PCR扩增产物进行回收纯化，可利用磁珠同时完成PCR产物的回收纯化与均一化混库，极大地提高了建库效率。
[0033]本专利技术的试剂盒和方法兼容性高，根据扩增子需要设计不同特异性引物。
[0034]上游引物和下游引物可以分别有不同的样本标记序列(Barcode)，可以任意组合
为上千种DNA文库，同时兼容不同扩增需求的样本，并通过本专利技术方法一次性完成这所有不同Barcode序列的DNA文库均一化混库。
附图说明
[0035]图1示出了基于磁珠进行均一化建库的流程图。
[0036]图2示出了不同文库测序后的产出reads。
具体实施方式
[0037]除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于磁珠的均一化建库试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括多对引物对，各引物对的上游引物和下游引物中至少一个连接有生物素分子，并且上游引物和下游引物中至少一个具有样本标记序列，各引物对的样本标记序列不同。2.利用权利要求1所述的试剂盒进行均一化建库的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，利用权利要求1所述的各引物对分别对不同样本来源的DNA样本进行PCR扩增，获得多个PCR扩增产物；S2，利用等量的链霉亲和素磁珠分别与步骤S1获得的多个PCR扩增产物混合，得到多个磁珠
‑
PCR产物混合液；S3，将步骤S2获得的多个磁珠
‑
PCR产物混合液，用磁力架分离磁珠；S4，对磁珠进行清洗；S5，将磁珠清洗后，加入ddH2O混匀磁珠，65℃3～10分钟，用磁力架分离，取上清，即为均一化的测序文库。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中，具体步骤为：利用磁珠清洗液重悬磁珠，混合所有磁珠，用磁力架分离，并弃上清；磁...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷文晓，李璐璐，肖晔，
申请(专利权)人：杭州联川生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：