一种用于检测男性精子质量的荧光染料及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用于检测男性精子质量的荧光染料及其应用，具体地涉及式（I）所示化合物、或其盐。采用本发明专利技术提供的检测方法镜检精子质量的客观性更强、准确性以及精确性更高。（I）。（I）。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测男性精子质量的荧光染料及其应用


[0001]本专利技术属于医药
，具体涉及一种用于检测男性精子质量的荧光染料及其应用。

技术介绍

[0002]精子质量评估是评判男性生育能力的一项很重要的指标。传统的精子质量评估技术，是采用相差显微镜和专用的血细胞计数板，用肉眼进行观察，主要对精子数量、精子活力和精子形态进行评估和分析。近二十年来，随着计算机技术的不断进步，临床上出现了采用专门的分析软件结合高分辨率的图像采集装置，即计算机辅助精子分析系统（CASA），其通过对精子运动轨迹、速度及动态参数的分析，从而鉴定精子的质量，使精子质量的研究得到较大改善。CASA虽然能够对精子密度和活力等参数进行测定，但是其具有一定的局限性，不能检测精子内部结构的变化，尤其是经冷冻保存或者受胁迫的精子，因其质膜完整性和线粒体活性易受到损伤，对精子的质量影响显著。近十年来，又出现了采用荧光显微镜和计算机技术相结合的荧光CASA技术，其优点是采用吖啶橙核酸荧光染料对精子DNA染色，可以很好地将精子细胞和杂质区分开来，提高了精子细胞计数的准确性。CASA虽然能够对精子密度和活力等参数进行测定，但是其具有一定的局限性，不能检测精子内部结构的变化，尤其是经冷冻保存或者受胁迫的精子，因其质膜完整性和线粒体活性易受到损伤，对精子的质量影响显著。
[0003]无论是传统的精子质量评估方法还是计算机辅助精子质量评估方法（包括荧光CASA），都不可能对全部的精子进行质量评估。为此，需要寻找出一种新的荧光染料及更精确的精子质量检测方法，以既能够提高实验的准确性、精确性，又能够方便、快捷、客观地检测精子质量。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种用于检测男性精子质量的荧光染料及其应用。
[0005]为达到上述目的，本专利技术提供以下技术方案。
[0006]第一方面，本专利技术提供了式（I）所示化合物、或其盐：（I），其中：R1、R2各自独立地选自氢、C1‑6烷基、硝基、羟基和卤素。
[0007]在一些优选的实施方案中，本专利技术的化合物为式（I）所示化合物、或其盐，其中：R1、R2各自独立地选自氢、C1‑3烷基、硝基、羟基和卤素；进一步优选地，R1、R2各自独立地选自氢、甲基、乙基、丙基、硝基、羟基、氟和氯。
[0008]在一些实施例中，式（I）化合物为以下化合物：，，，和。
[0009]本专利技术第二方面提供了上述式（I）所示化合物、或其盐在制备检测男性精子质量的荧光染料中的用途。
[0010]本专利技术第三方面提供了一种式（I）所示的荧光染料用于检测男性精子质量的方法，其包括如下步骤：(1) 荧光染料配制：将式(I)所示的荧光染料和Syto16分别溶于蒸馏水中，储存；(2) 精液染色：将式(I)所示的荧光染料和Syto16与待检精液混合染色；(3) 检测：采用流式细胞仪对步骤(2)中精子进行检测；其中，所述的式(I)所示的荧光染料具有式(I)所示的结构：(I)。
[0011]进一步优选地，所述步骤（1）具体为：将式(I)所示的荧光染料和Syto16分别溶于蒸馏水中，均配成浓度为1mg/mL的储存液，按照试剂储存要求，放于
‑
20℃保存。
[0012]进一步优选地，所述步骤（2）中待检精液为新鲜液化的人类精液标本，用BSA
‑
PBS缓冲液洗涤制成。
[0013]进一步优选地，所述步骤（2）中将式(I)所示的荧光染料和Syto16与待检精液混合时，加入荧光染料的先后顺序无影响。
[0014]进一步优选地，所述步骤（2）中染色时间为3
‑
10min。
[0015]进一步优选地，所述步骤（2）中染色后，进一步包括放置、离心、洗涤、重悬的步骤；更进一步优选地，所述步骤（2）具体为将式(I)所示的荧光染料和Syto16两种储存液分别稀释至100μg/mL，取一定量精液，加入两种染液混合（加入染液的先后顺序无影响），使待测样
品的染液终浓度均为10μg/mL，在室温下避光放置3
‑
10min，离心（300
×
g，5min），0.01M PBS（pH7.4）冲洗，重复洗涤离心2~3次，PBS重悬，流式细胞仪检测。
[0016]进一步优选地，所述步骤（3）流式细胞仪参数为：向前散射FSC与侧向散射SSC为线性放大，荧光通道FL1和FL2对数放大，测每个精子Syto16和式(I)所示的荧光染料的荧光强度，每份悬液检测10000~20000个精子左右。
[0017]本专利技术与现有技术相比，其显著优点在于：第一，本专利技术设计并合成了结构新颖的式(I)所示的荧光染料，结合式(I)所示的荧光染料和Syto16染色与流式细胞术来检测精子质量，与FITC和Syto16染色相比较，本专利技术的检测方法检出精子数量更多，且能准确测定精子的存活比例，在不损伤精子的情况下，方便快捷地区分各个状态的精子，进而客观准确地评价精子质量。
[0018]第二，本专利技术通过一次检测可以获得多个参数，不仅能够清晰地区分不同状态的精子并显示其比例，得出精子死亡率、存活率、质膜受损率以及具线粒体活性比例，还可以避免主观因素造成的精确率较低的现象，同时减少人为因素对检测结果的影响，确保检测结果的准确性及精确性。
具体实施方式
[0019]下面代表性的实施例是为了更好地说明本专利技术，而非用于限制本专利技术的保护范围。以下实施例中使用的材料如无特殊说明均为商购获得。
[0020]实施例1 荧光染料FITC
‑
TRI的制备在反应瓶中，将异硫氰酸荧光素(FITC，3210mg，8.24mmol)溶于N,N
‑
二甲基甲酰胺(100mL)，然后在溶液中加入三乙胺(1.14mL，8.24mmol)、对硫氰基苯胺(CAS号：15191
‑
25
‑
0，1125mg，7.49mmol)。将反应在黑暗中和在室温下在恒定搅拌下过夜。随后，加入水（100mL），并用乙酸乙酯（100mL
×
2）萃取，有机相并用饱和食盐水（50mL）洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，得荧光染料FITC
‑
TRI。ESI
‑
MS m/z=540.1[M+1]+
。
[0021]实施例2 荧光染料FITC
‑
NO的制备在反应瓶中，将异硫氰酸荧光素(FITC，3210mg，8.24mmol)溶于N,N
‑
二甲基甲酰胺(100mL)，然后在溶液中加入三乙胺(1.14mL，8.24mmol)、2
‑
硝基
‑4‑
硫氰基苯胺(CAS号：
54029
‑
45
‑
7，1462mg，7.49mmol)。将反应在黑暗中和在室温下在恒定搅拌下过夜。随后，加入水（100mL），并用乙酸乙酯（100本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种式（I）所示化合物、或其盐：（I），其中：R1、R2各自独立地选自氢、C1‑6烷基、硝基、羟基和卤素。2.根据权利要求1所述的式（I）所示化合物、或其盐，其特征在于，R1、R2各自独立地选自氢、C1‑3烷基、硝基、羟基和卤素。3.根据权利要求1所述的式（I）所示化合物、或其盐，其特征在于，式（I）化合物为以下化合物：，，，和。4.根据权利要求1
‑
3之任一项所述的式（I）所示化合物、或其盐在制备检测男性精子质量的荧光染料中的用途。5.一种权利要求1
‑
3之任一项所述的式（I）所示化合物、或其盐用于检测男性精子质量的方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1) 荧光染料配制：将式(I)所示的荧光染料和Syto16分别溶于蒸馏水中，储存；(2) 精液染色：将式(I)所示的荧光染料和Syto16与待检精液混合染色；(3) 检测：采用流式细胞仪对步骤(2)中精子进行检测；其中，所述的式(I)所示的荧光...

【专利技术属性】
技术研发人员：李树莲，杨波，
申请(专利权)人：普迪特泰州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：