特异性检测鉴别乳酸片球菌的引物和探针及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物菌种检测技术领域，涉及一种特异性检测鉴别乳酸片球菌的引物和探针及其应用。本专利通过ERIC

【技术实现步骤摘要】
特异性检测鉴别乳酸片球菌的引物和探针及其应用


[0001]本专利技术属于生物菌种检测
，涉及一种特异性检测鉴别乳酸片球菌的引物和探针及其应用。

技术介绍

[0002]乳酸片球菌，细胞圆球状，一般细胞成对生，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。接触酶阴性，不产细胞色素。产酸，调节胃肠道菌群，维持肠道微生态平衡，促进身体新陈代谢。在动物体内对病原微生物有颉颃作用，可竞争性地抑制病原微生物，在一定程度上保护有益菌的生长，增强动物机体的免疫功能，产生有益的代谢产物，激活酸性蛋白酶的活性，参与机体的新陈代谢，防止有害物质产生。起到调节肠粘膜电解质和水分平衡的作用，促进胃液分泌，增强消化功能，可用于治疗消化不良和慢性腹泻。乳酸片球菌能产生细菌素。抗生素在抑制原菌增殖上发挥着重要作用，但抗生素的过度或不合理使用，会使一些细菌产生耐药性。并且会在体内残留积累，而乳酸片球菌产生的细菌素，可通过调节肠道菌群有效改善疾病状态。在畜牧业上的发展具有广阔前景，将乳酸片球菌替代抗生素，不仅有利于动物的胃肠道，而且能增强免疫力，抑制细菌感染，降低抗生素对动物机体的损伤，从而减少疾病的发生，增殖增产。
[0003]由原卫生部公布的《可用于食品的菌种名单》可知，可用于食品的菌种包含21个菌株，乳酸片球菌因具有抗菌、抗炎、健脾养胃、增强机体免疫作用。市场上出现的含可食用菌种的乳酸片球菌产品更是层出不穷。随着人们生活水平的提高，快速检验众多产品中是否含有乳酸片球菌，成为亟需解决得问题。目前，分子学中通常采用16S rRNA方法进行基因组扩增结合基因比对检出乳酸片球菌，试验周期长，花费较高。肠杆菌基因间重复一致序列 ( enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence，ERIC) 广泛存在于肠杆菌科细菌基因组中，具有较强保守性，依据此重复性序列设计引物，对细菌基因组进行扩增，可以产生 DNA 指纹图谱，用于细菌分类鉴定。但是目前针对乳酸片球菌检测，还没有很理想的检测方法被报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术针对传统乳酸片球菌检测中存在的问题提出一种新型的特异性检测鉴别乳酸片球菌的引物和探针及其应用。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术是采用下述的技术方案实现的：本专利通过ERIC
‑
PCR技术，以一株乳酸片球菌HP
‑
B1099为基础，设计并获得两条引物探针，可简单快速的实现复杂样本中微量乳酸片球菌的检出，解决了传统方法的弊端。可在八种基因组DNA或八种菌株混合液及多株近缘菌株中快速特异性地鉴别极低浓度的乳酸片球菌，大大提高了检测的效率。此方法在人和动物肠道菌群生态结构研究、医药健康、畜牧养殖及商业化生产与运用等方面具有广泛的应用前景。
[0006]本专利技术基于新型ERIC
‑
PCR技术进行乳酸片球菌HP
‑
B1099基因组DNA的多态性扩
增，对目的ERIC片段进行规模回收纯化，连接载体，设计引物探针，运用两对引物探针进行PCR快速从复杂基因组DNA中鉴别乳酸片球菌。提供一种特异性检出乳酸片球菌的方法。
[0007]本专利技术从乳酸片球菌中提取全基因组DNA，对两条目的片段进行回收，将两条ERIC目的片段分别连接T载体测序，设计两对引物探针，验证设计引物，验证引物探针特异性、普适性及检测限度。具体步骤如下：1. 提取乳酸片球菌HP
‑
B1099全基因组DNA。
[0008]2. 根据四因素三水平正交实验找到乳酸片球菌基因组DNA的ERIC
‑
PCR最佳扩增条件，进行乳酸片球菌HP
‑
B1099基因组DNA的ERIC多态性扩增。
[0009]3. 对乳酸片球菌HP
‑
B1099 ERIC基因片段进行回收、纯化，经基因测序和比对有两条目的基因片段在乳酸菌中具有特异性。
[0010]4. 将已纯化的胶回收片段连接T载体，测序及基因比对分析。
[0011]5. 设计两对特异性引物，通过琼脂糖凝胶电泳验证设计的引物探针。
[0012]6. 将混合样本采用引物探针进行PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳验证引物探针特异性、普适性、检测限度及市场应用潜力。
[0013]如步骤1所述，提取乳酸片球菌HP
‑
B1099全基因组DNA，挑取乳酸片球菌HP
‑
B1099接种于MRS平板上，37 ℃厌氧环境下培养2天，刮取少量菌体于EP管中，加入450 μL1
×
TE及50 mg
·
mL
‑1的溶菌酶20 mL，950 rpm
·
min
‑137℃培养12
‑
14 h；加入50 μL20% SDS及5 μL浓度为20 mg
·
mL
‑1蛋白酶K，950 rpm
·
min
‑1震匀1 min，55 ℃水浴60 min，每隔15 min拿出轻微上下震荡；加入550 μL苯酚、氯仿与异戊醇为25：24：1的溶液，吹吸混匀，12500 rpm
·
min
‑1，离心10 min，将上清转移到另一试管中，再次加入550 μL苯酚、氯仿与异戊醇为25：24：1的溶液，吹吸混匀，12500 rpm
·
min
‑1，离心10 min；取上清加入800 μL无水乙醇及80 μL3 mol
·
L
‑1乙酸钠，室温静置30 min；12500 rpm
·
min
‑1离心10 min，弃上清，加入200 μL70%无水乙醇，轻摇洗盐，12500 rpm
·
min
‑1离心5 min，弃乙醇；37 ℃烘25 min后加入50 μL 1
×
TE溶解DNA，
‑
20 ℃保存备用。
[0014]如步骤2所述，乳酸片球菌ERIC
‑
PCR反应体系：DNA模板1 μL，上述引物各1 μL，2
×
Taq Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，反应总体积25 μL。最佳反应程序：92
‑
98℃预变性8
‑
12 min，92
‑
98℃变性1 min，44
‑
46℃退火35
‑
45 s，65
‑
78℃延伸210 s，执行30
‑
34个循环，16℃后延伸。DNA模板浓度100
‑
300 ng
·
mL
‑1，引物浓度30
‑
50 μmol
·
L
‑1，Mg
2+
浓度为1.75
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.特异性检测鉴别乳酸片球菌的引物和探针，其特征在于，引物序列为：上游ERIC
‑
F
‑
N：5
’‑
AAAGTAAGTGRCTGGGUTGAGCGC
‑3’
，下游ERIC
‑
R
‑
N：5
’‑
AATGTAAGCVCCTGGGRATTCACA
‑3’
；探针序列为：1099
‑
750
‑
F:（5
’‑
TGGAATCACACATCACACCAGG
‑3’
），1099
‑
750
‑
R:（5
’‑
GTTGTCCTGGACTCTCCAAATC
‑3’
）；1099
‑3‑
F:（5
’‑
GTGCCATTGAACTAGCCGTGTTAC
‑3’
），1099
‑3‑
R:（5
’‑
GCTTCCGCCATTCA...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯少阳，孙林慧，彭倩，韩仁皓，李典，
申请(专利权)人：菏泽学院，
类型：发明
国别省市：