用于构建OCA-1A型白化病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了用于构建OCA

【技术实现步骤摘要】
用于构建OCA
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1A型白化病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体属于基因编辑
，更具体基于CRISPR/Cas9系统及ssODN同源重组技术的用于构建OCA
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1A型白化病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。

技术介绍

[0002]基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因编辑到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑技术，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。
[0003]同源重组(HDR)是通过序列同源性交换DNA序列信息：即修复模板中包含所需插入片段，修复模板的两端则是与插入位点附近具有序列同源性的重组臂。过去通常使用双链DNA(dsDNA)作为修复模板，但最近的研究揭示了单链寡核苷酸脱氧核苷酸(ssODN)作为HDR供体模板的优越性。首先，ssODN作为供体模板比dsDNA模板的插入位点特异性高，dsDNA模板容易产生随机插入。其次，ssODN对同源重组臂的长度要求比dsDNA模板更短，单侧30
‑
60个碱基的重组臂设计可以获得高效且稳定的HDR，相比类似的dsDNA模板，其提供的插入效率更高。第三，dsDNA容易被NHEJ修复途径合并，从而导致同源臂的复制或者dsDNA模板的部分整合，而ssODN就不易产生这种现象。另外，dsDNAs对培养的细胞是有害的，线型或者质粒dsDNAs的转染效率较低，并使细胞产生不良反应，而ssODN模板在这些方面就更有优势。
[0004]白化病(albinism)是由于黑色素合成减少或缺乏而导致的多种遗传性疾病的总称，主要表现为皮肤、毛发以及眼部的色素减退。多种基因的突变均可导致白化病的症状。根据色素缺失的部位以及有无其他系统异常，可将白化病分为非综合征性白化病和综合征性白化病两大类。非综合征白化病又可再分为只有眼部色素缺乏的眼白化病(OA)和皮肤、毛发、眼睛均有色素缺失(即具有全身症状)的眼及皮肤白化病(oculocutaneous albinism，OCA)。
[0005]OCA是一组以眼、皮肤、毛发黑色素沉着减少或缺乏为主要临床表现的常染色体隐性遗传病。超过90％的白化病患者为OCA，一般是由黑色素合成或转运相关基因突变所引起的，主要临床表现为普遍色素沉着不足，眼部改变包括黄斑中心凹发育不良、屈光不正、视力低下、畏光、虹膜半透明、眼球震颤、眼底着色不足及视觉纤维通路异常等。近年来，OCA已根据发生突变的基因进行分类：酪氨酸酶基因(TYR)突变导致OCA1,OCA2基因(曾被命名为P基因)突变导致OCA2，酪氨酸酶相关蛋白
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1基因(TYRP1)突变导致OCA3，SLC45A2基因(曾被命名为MATP或AIM1)突变导致OCA4。
[0006]OCA
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1型约占OCA的40
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50％，是TYR基因突变致使其编码的酪氨酸酶功能丧失引起的。已有研究结果表明，根据酪氨酸酶活性是否完全丧失，OCA
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1可分为两型：OCA
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1A和OCA
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1B，两者在出生时无法区分。OCA
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1A患者酪氨酸酶活性完全丧失，是最严重的类型，患者皮肤和眼睛色素完全缺失，视觉敏锐度下降至5％。OCA
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1B患者体内酪氨酸酶活性明显下降，
但尚未完全缺失，患者皮肤、头发和眼色素可以随年龄增长而增加，并可被晒黑。
[0007]研究由TYR突变导致OCA
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1型的发生发展机制及研发相应的药物均需要在动物模型的基础上进行，目前常用的动物模型为小鼠模型，然而小鼠不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，不能真实地模拟人类正常的生理、病理状态。而猪作为大动物，是人类长期以来主要的肉食供应动物，其体型大小和生理功能与人类近似，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，是理想的人类疾病模型动物。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供用于构建OCA
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1A型白化病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。
[0009]本专利技术提供了一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：用SEQ ID NO：18所示的DNA分子取代猪细胞的染色体DNA中SEQ ID NO：19所示的DNA分子，得到重组细胞。
[0010]用SEQ ID NO：18所示的DNA分子取代猪细胞的染色体DNA中SEQ ID NO：19所示的DNA分子的实现方式为：将TYR
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gRNA1、TYR
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gRNA2、TYR
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E1mut
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ss126和NCN蛋白共转染猪细胞。
[0011]所述共转染具体采用电击转染的方式。
[0012]电击转染的参数设置具体可为：1450V、10ms、3pulse。
[0013]所述共转染具体可采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪。
[0014]本专利技术还提供了TYR
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gRNA1、TYR
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gRNA2、TYR
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E1mut
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ss126和NCN蛋白在制备试剂盒中的应用。
[0015]本专利技术还提供了TYR
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gRNA1、TYR
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gRNA2、TYR
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E1mut
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ss126和PRONCN蛋白在制备试剂盒中的应用。
[0016]本专利技术还提供了TYR
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gRNA1、TYR
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gRNA2、TYR
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E1mut
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ss126和特异质粒在制备试剂盒中的应用。
[0017]本专利技术还提供了一种试剂盒，包括TYR
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gRNA1、TYR
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gRNA2、TYR
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E1mut
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ss126和NCN蛋白。
[0018]本专利技术还提供了一种试剂盒，包括TYR
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gRNA1、TYR
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gRNA2、TYR
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E1mut
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ss126和PRONCN蛋白。
[0019]本专利技术还提供了一种试剂盒，包括TYR
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gRNA1、TYR
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gRNA2、TYR
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E1mut
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ss126和特异质粒。
[0020]以上任一所述试剂盒还包括猪细胞。
[0021]以上任一所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：用SEQ ID NO：18所示的DNA分子取代猪细胞的染色体DNA中SEQ ID NO：19所示的DNA分子，得到重组细胞。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：用SEQ ID NO：18所示的DNA分子取代猪细胞的染色体DNA中SEQ ID NO：19所示的DNA分子的实现方式为：将TYR
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gRNA1、TYR
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gRNA2、TYR
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E1mut
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ss126和NCN蛋白共转染猪细胞；所述TYR
‑
gRNA1为sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：16中第3
‑
22位核苷酸所示；所述TYR
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gRNA2为sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：17中第3
‑
22位核苷酸所示；所述TYR
‑
E1mut
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ss126为SEQ ID NO：18所示的单链DNA分子；所述NCN蛋白为Cas9蛋白或具有Cas9蛋白的融合蛋白。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：猪细胞、TYR
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gRNA1、TYR
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gRNA2、TYR
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E1mut
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ss126和NCN蛋白的配比依次为：10万个猪细胞：0.8
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1.2μg TYR
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gRNA1：0.8
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1.2μg TYR
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gRNA2：1.8
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2.2μg TYR
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E1mut
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ss126：3
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5μg NCN蛋白。4.TYR
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gRNA1、TYR
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gRNA2、TYR
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E1mut
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ss126和NCN蛋白在制备试剂盒中的应用；TYR
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gRNA1为权利要求2中所述的TYR
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gRNA1；TYR
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gRNA2为权利要求2中所述的TYR
‑
gRNA2；TYR
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E1mut
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ss126为权利要求2中所述的TYR
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E1mut
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ss126；NCN蛋白为权利要求2中所述的NCN蛋白；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组细胞；(b)制备白化病模型猪；(c)制备白化病细胞模型或白化病组织模型或白化病器官模型。5.TYR
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gRNA1、TYR
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gRNA2、TYR
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E1mut
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ss126和PRONCN蛋白在制备试剂盒中的应用；TYR
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gRNA1为权利要求2中所述的TYR
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gRNA1；TYR
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gRNA2为权利要求2中所述的TYR
‑
gRNA2；TYR
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E1mut
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ss126为权利要求2中所述的TYR
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E1mut
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ss126；所述PRONCN蛋白自上游至下游依次包括如下元件：信号肽、分子伴侣蛋白、蛋白标签、蛋白酶酶切位点、核定位信号、Cas9蛋白、核定位信号；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组细胞；(b)制备白化病模型猪；(c)制备白化病细胞模型或白化病组织模型或白化病器官模型。6.TYR
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gRNA1、TYR
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gRNA2、TYR
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E1mut
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ss126和特异质粒在制备试剂盒中的应用；TYR
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gRNA1为权利要求2中所述的TYR
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gRNA1；TYR
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gRNA2为权利要求2中所述的TYR
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gRNA2；TYR
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E1mut
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ss126为权利要求2中所述的TYR
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E1mut
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ss126；所述特异质粒自上游至下游依次包括如下元件：启动子、操纵子、核糖体结合位点、PRONCN蛋白的编码基因、终止子；所述PRONCN蛋白自上游至下游依次包括如下元件：信号肽、分子伴侣蛋白、蛋白标签、蛋白酶酶切位点、核定位信号、Cas9蛋白、核定位信号；所述试剂盒...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛冬，汪滔，刘璐，马翔，陶裴裴，曾为俊，王磊，程锐，赵泽英，黄彩云，段星，
申请(专利权)人：南京启真基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：