一种多重扩增子测序文库的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种多重扩增子测序文库的制备方法及其应用。所述制备方法包括：提供两组多重引物组合，其包括第一多重引物组合和第二多重引物组合，所述第一多重引物组合包括根据目标扩增子设计并合成的特异性引物，所述第二多重引物组合包括根据目标扩增子设计并合成的融合引物；将所述第一多重引物组合和第二多重引物组合混合，形成混合引物；以目标样本的DNA为模板，采用该混合引物对目标样本的DNA进行多重PCR扩增反应，获得目标扩增子的测序文库。本发明专利技术采用两组引物进行一轮多重PCR扩增，在制备过程中避免使用低效率的连接酶、消化酶等，使文库制备过程更加简单、便捷，且大幅度降低时间和试剂成本，从而提高文库的制备效率。率。率。

【技术实现步骤摘要】
一种多重扩增子测序文库的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种测序文库的制备方法，尤其涉及一种多重扩增子测序文库的制备方法及其应用，属于生物检测


技术介绍

[0002]近年来，下一代基因测序技术(Next Generation Sequencing，NGS)作为精准医学领域研究的精尖武器，被称为未来十大改变人类的科技之一。NGS具有高通量、高敏感性、低成本、测序时间短等诸多优势，因此也被称为“高通量测序技术”。目前，高通量测序技术已广泛的应用于动植物以及微生物的基因组、转录组、表观遗传组、蛋白组、代谢组等方面的研究。随着NGS技术的快速发展也加速了该技术在精准医疗领域的应用，运用NGS技术能够实现对已知或未知致病基因位点进行检测并对肿瘤基因进行精准分型，将有助于更加完整且真实的还原肿瘤等疾病变异的全景。目前，NGS技术已被用于癌症基因检测、遗传病和代谢疾病基因筛查与检测等临床应用中。各大测序平台在测序之前都必须通过繁琐的操作步骤使待测样品转换成适合测序平台检测的测序样本，这一转换过程即为文库制备。文库的质量决定了测序数据的准确性，因此文库制备过程是高通量测序中至关重要的一步。以Illumina平台的传统文库制备过程为例，该文库制备过程包括核酸序列片段化或PCR扩增获得扩增子、末端修复、片段筛选、加A尾、连接测序接头、PCR富集等步骤，人工操作步骤多，需多次纯化以去除非目标片段，文库损失率高，多步操作易导致样品之间的交叉污染，耗时长约半天，且文库制备成本高，约400
‑
1000元/例。

技术实现思路

[0003]本专利技术的主要目的在于提供一种多重扩增子测序文库的制备方法，以克服现有技术的不足。
[0004]本专利技术的另一目的在于提供一种测序方法。
[0005]为实现前述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案包括：
[0006]本专利技术实施例提供了一种多重扩增子测序文库的制备方法，其包括：
[0007]根据目标扩增子设计并合成两组多重引物组合，其包括第一多重引物组合和第二多重引物组合，所述第一多重引物组合包括根据目标扩增子设计并合成的特异性引物，所述第二多重引物组合包括根据目标扩增子设计并合成的融合引物；
[0008]将所述第一多重引物组合和第二多重引物组合混合，形成混合引物；
[0009]以目标样本的DNA为模板，采用所述混合引物对目标样本的DNA进行多重PCR扩增反应，获得目标扩增子的测序文库。
[0010]在一些实施例中，所述第一多重引物组合与第二多重引物组合的摩尔比为0.1～10∶1。
[0011]在一些实施例中，所述第一多重引物组合所含引物序列包括根据目标扩增子设计的特异性扩增引物，其包括与目标扩增子对应的特异性上游引物序列、特异性下游引物序
列，能够实现对目标序列的特异性扩增。
[0012]在一些实施例中，所述第二多重引物组合所含引物序列包括融合引物序列，其包括与目标扩增子对应的上游融合引物序列、下游融合引物序列。
[0013]进一步的，所述融合引物序列从5
’
端至3
’
端依次包括测序接头序列、标签序列、测序引物序列和根据目标扩增子设计的特异性引物序列，能够实现对目标扩增子进行测序接头序列、标签序列及测序引物序列的连接，并进一步实现终产物的富集。
[0014]本专利技术实施例还提供了一种测序方法，其包括：采用前述方法制备多重扩增子测序文库，之后进行测序分析。
[0015]较之现有技术，本专利技术的有益效果在于：
[0016]1)本专利技术提供的测序文库制备方法采用两组引物进行一轮多重PCR扩增，在制备过程中避免使用低效率的连接酶、消化酶等，使文库制备过程更加简单、便捷，且大幅度降低时间和试剂成本；仅需约3小时即可完成文库制备，每例成本约20～50元；且只需一步简单的纯化步骤，大大降低了因多步纯化导致的文库损失；通过使用两组多重引物组合，避免使用一组较长融合引物在PCR扩增过程中更易带来的非特异性扩增以及较多的引物二聚体，从而提高文库的制备效率；
[0017]2)本专利技术适用于双标签测序，双标签可以变化出更多种组合，且能够降低标签串扰的比例，能够提高检测的灵敏度，并能使测序读长增加；并且在初始引物设计时即引入标签序列，使后续人工操作步骤大大简化，极大可能的降低了不同样品文库之间的交叉污染。
附图说明
[0018]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0019]图1是本专利技术一典型实施例中的最终扩增子文库纯化后进行Agilent4150的检测结果图。
具体实施方式
[0020]鉴于现有技术的不足，本案专利技术人经长期研究和大量实践，得以提出本专利技术的技术方案，主要是提供一种多重扩增子测序文库的制备方法，能够实现目标扩增子文库的简单、快速、高效的制备。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
[0021]本专利技术实施例的一个方面提供的一种多重扩增子测序文库的制备方法，其包括：
[0022]根据目标扩增子设计并合成两组多重引物组合，其包括第一多重引物组合和第二多重引物组合，所述第一多重引物组合包括根据目标扩增子设计并合成的特异性引物，所述第二多重引物组合包括根据目标扩增子设计并合成的融合引物；
[0023]将所述第一多重引物组合和第二多重引物组合混合，形成混合引物；
[0024]以目标样本的DNA为模板，采用所述混合引物对目标样本的DNA进行多重PCR扩增反应，获得目标扩增子的测序文库。
[0025]在一些实施例中，所述第一多重引物组合与第二多重引物组合的摩尔比为0.1～
10∶1。
[0026]在一些实施例中，所述多重扩增子测序文库的制备方法包括：设计并合成两组多重引物组合，多重引物组合一包括根据目标扩增子设计并合成的特异性引物；多重引物组合二包括根据目标扩增子设计并合成的融合引物；将多重引物组合一和多重引物组合二按照0.1～10∶1的摩尔比例进行混合，以DNA为模板，经过一轮多重PCR扩增获得目标扩增子的测序文库。
[0027]在一些实施例中，所述第一多重引物组合所含引物序列为根据目标扩增子设计的特异性扩增引物，其包括与目标扩增子对应的特异性上游引物序列、特异性下游引物序列，能够实现对目标序列的特异性扩增。
[0028]进一步地，所述第一多重引物组合包括根据多个目标扩增子设计的特异性扩增引物组成的特异性引物组合。
[0029]换一种角度讲，在本专利技术中，所述第一多重引物组合的引物序列为根据目标扩增子设计的特异性扩增引物；当目标扩增子为多条时，组成特异性引物组合；该组引物序列较短，能够实现对目标序列的特异性扩增。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多重扩增子测序文库的制备方法，其特征在于包括：根据目标扩增子设计并合成两组多重引物组合，其包括第一多重引物组合和第二多重引物组合，所述第一多重引物组合包括根据目标扩增子设计并合成的特异性引物，所述第二多重引物组合包括根据目标扩增子设计并合成的融合引物；将所述第一多重引物组合和第二多重引物组合混合，形成混合引物；以目标样本的DNA为模板，采用所述混合引物对目标样本的DNA进行多重PCR扩增反应，获得目标扩增子的测序文库。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述第一多重引物组合与第二多重引物组合的摩尔比为0.1～10:1。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述第一多重引物组合所含引物序列为根据目标扩增子设计的特异性扩增引物，其包括与目标扩增子对应的特异性上游引物序列、特异性下游引物序列，能够实现对目标序列的特异性扩增；所述第一多重引物组合包括根据多个目标扩增子设计的特异性扩增引物组成的特异性引物组合。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述第二多重引物组合所含引物序列为融合引物序列，其包括与目标扩增子对应的上游融合引物序列、下游融合引物序列；所述融合引物序列从5
’
端至3
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端依次包括测序接头序列、标签序列、测序引物序列和根据目标扩增子设计的特异性引物序列，能够实现对目标扩增子进行测序接头序列、标签序列及测序引物序列的连接，并进一步实现终产物的富集；所述第二多重引物组合包括根据多个目标扩增子设计的多条融合引物组成的融合引物组合。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述第一多重引物组合的特异性上游引物序列与所述第二多重引物组合的上游融合引物中的特异性引物序列相同，或者，所述第一多重引物组合的特异性上游引物序列在所述第二多重引物组合的上游融合引物中的特异性引物序列的5
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端上游。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述第一多重引物组合的特异性下游引物序列与所述第二多重引物组合的下游融合引物中的特异...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑建萍，吕天琦，蔺元斌，
申请(专利权)人：中国科学院宁波材料技术与工程研究所，
类型：发明
国别省市：