一种用于完整厚生物组织高分辨成像的制片方法及成像方法技术

本发明专利技术公开了一种用于完整厚生物组织高分辨成像的制片方法及成像方法，所述制片方法包括：S1，取一块盖玻片放置在第一载物片上，用胶带覆盖两者；S2，挖去盖玻片区域范围内覆盖的胶带，用疏水介质处理挖开区域的边缘；S3，将待观察的组织样品转移至盖玻片上，吸干样品液体，滴加抗荧光淬灭剂静置后，吸干样品溶剂，滴加凝胶，使样品固定在盖玻片上；S4，取下盖玻片，放置在第二载物片上，使组织样品位于盖玻片和第二载物片之间，通过胶带将盖玻片与第二载物片固定连接，完成制片。本发明专利技术能在保持组织完整性的同时，高分辨的观察特定细胞在厚组织内部的分布和数量，且制备方法简单，不受光路、尺寸等限制，适用于大多数正置或倒置显微镜。镜。镜。

【技术实现步骤摘要】
一种用于完整厚生物组织高分辨成像的制片方法及成像方法


[0001]本专利技术涉及生物组织显微观察领域，具体涉及一种用于完整厚生物组织高分辨成像的制片方法及成像方法。

技术介绍

[0002]在生命科学研究和临床病理学分析中，对一定厚度范围内的组织整体进行高分辨的成像，可以直观的发现组织中特定类群细胞的数量和排列以及目标蛋白的表达差异等规律，从而辅助揭示疾病发生发展的原因。然而，目前对较厚的组织样品进行研究时，通常采用以下方法：
[0003](1)对较厚的组织进行透明化处理，然后使用光片显微镜进行成像。然而光片显微镜较贵，且样品制备过程复杂，适合对体积更大的组织或者样品进行成像；
[0004](2)将组织进行切片，切成5
‑
20μm厚度的薄片后，通过显微镜进行实验观察。但该方法存在以下缺点：一方面，切片过程中组织有损耗；另一方面，组织切好处理后，进行成像，相当于对这块组织的局部切面进行观察，无法从组织整体进行观察，不利于从整体判断该组织样品中细胞或目标基因的分布、表达特点；
[0005](3)对一定厚度组织成像时，也可用人为的方法，将组织按压在带玻璃底的观察皿中，但样品组织与玻璃底之间总是会出现一定空隙，占据了部分镜头的工作距离范围，导致可用于样品的深度距离减少。
[0006]综上所述，如何在保持组织完整性的同时，高分辨的观察特定细胞在厚组织内部的分布和数量，是生物学研究和医学研究亟需解决的问题。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种用于完整厚生物组织高分辨成像的制片方法及成像方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0008]为解决上述问题，本专利技术首先提供了一种用于完整厚生物组织高分辨成像的制片方法，包括以下步骤：
[0009]S1，取一块盖玻片放置在第一载物片上，用胶带覆盖所述的盖玻片和第一载物片；
[0010]S2，挖去盖玻片区域范围内覆盖的胶带，暴露大部分盖玻片，使用疏水介质处理挖开区域的边缘；
[0011]S3，将待观察的组织样品转移至盖玻片上，吸干样品液体，滴加抗荧光淬灭剂，静置1～3h后，再次吸干样品溶剂，滴加凝胶，使样品固定在盖玻片上；
[0012]S4，取下盖玻片，放置在第二载物片上，使所述的组织样品位于盖玻片和第二载物片之间，通过胶带将盖玻片四周与第二载物片固定连接，完成制片。
[0013]优选地，所述的组织样品的厚度为280～480μm。
[0014]优选地，步骤S1中，根据组织样品的厚度，覆盖一层至多层胶带，所述的胶带的总厚度不超过组织样品的厚度。
[0015]优选地，步骤S2中，还包括：使用疏水介质将挖开区域内的盖玻片分成多个样品室。
[0016]优选地，步骤S3中，所述的凝胶为低熔点琼脂糖。
[0017]优选地，步骤S4中，胶带固定时，保证所述盖玻片与第二载物片之间的高度保持一致。
[0018]优选地，所述盖玻片尺寸为24mm
×
60mm，厚度为0.13mm～0.17mm；所述第一载物片和第二载物片的尺寸均为25mm
×
75mm，厚度为1mm～1.2mm。
[0019]本专利技术另一方面还提供了一种完整厚生物组织的高分辨成像方法，包括以下步骤：
[0020](1)获取待观察的样品组织，采用前面任一项所述的制片方法制得玻片样本；
[0021](2)将所述的玻片样本水平放在显微镜载物台上，滴加镜头所需介质，浸润镜头，对样品组织进行观察。
[0022]优选地，所述的显微镜包括：正置激光共聚焦显微镜、倒置激光共聚焦显微镜。
[0023]优选地，所述显微镜采用40倍水镜。
[0024]优选地，使用正置激光共聚焦显微镜进行观察时，在滴加介质水之前，还包括以下操作：使用疏水介质在所述盖玻片上圈出介质加入区域，所述的介质加入区域覆盖样本组织。
[0025]相对于现有技术，本专利技术的有益效果是：
[0026](1)本专利技术提供的用于完整厚生物组织高分辨成像的制片方法及成像方法，能够在保持组织(280～480μm)完整性的同时，高分辨的观察特定细胞在厚组织内部的分布和数量，且制备方法简单，不受光路、尺寸等的限制，可适用于大多数正置或倒置显微镜，应用前景好。
[0027](2)本专利技术使用疏水介质对盖玻片进行区域划分，用于在样品周围形成目标圈范围，方便后续拍照时查找样品，解决了成像观察时，目标物难以寻找的问题；在翻转后的盖玻片上，用疏水的材料画上圈后，滴入镜头所需介质，可以防止介质在拍照时扩散，蒸发干，从而维持拍照环境的稳定。
[0028](3)本专利技术将放置在盖玻片上的样本以此经过吸干水分、加入低熔点琼脂糖浸润等操作，一方面，将样品紧密固定在盖玻片上，减少了样品与盖玻片间的空间损耗，有效利用镜头的工作距离，从整体上对样本进行成像；另一方面，样品在浸润低熔点琼脂糖后，会在一定程度上被撑起来，缓解样品被吸干水分后的萎缩程度，从而在拍照时尽可能的维持了原有的形态。
附图说明
[0029]图1为本专利技术用于完整厚生物组织高分辨成像的制片过程示意图。
[0030]图2为本专利技术方法制得的玻片样本在正置、倒置显微镜下的成像示意图。
[0031]图3为本专利技术实施例2的成像结果图；(A)斑马鱼心脏中细胞核。右上角是图中白框部分放大，细胞核呈点状；(B)靠近镜头的位置可观察到纤连蛋白呈现点状，右上角是图中白框部分放大，纤连蛋白呈现点状；(C)肌动蛋白F
‑
actin在斑马鱼心肌中的排列方式，右上角是图中白框部分放大；(D)纤连蛋白在心脏中呈现与F
‑
actin类似的排列方式，右上角是
图中白框部分放大。
具体实施方式
[0032]以下结合附图和实施例对本专利技术的技术方案做进一步的说明。应当指出，对于本
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本专利技术的保护范围。
[0033]在本专利技术的描述中，需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
[0034]显微镜镜头的数值孔径(NA)值与工作距离(WD)成反比。NA值越大，分辨率越高，但工作距离却越短，可拍摄的组织样本厚度也就越薄。因此，本申请专利技术人为了能够在保持组织完整性的同时，高分辨的观察特定细胞在厚组织内部的分布和数量，一方面，通过比较不同放大倍数、不同镜头介质下的物镜参数，筛选出兼顾高分辨率和高工作距离成像的物镜参数，最终发现，选择40
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的水镜进行厚生物组织(280～480μm)成像，利于从整体观察该厚度范围内样本的精细结构、细胞分布特点、目标蛋白的表达范围和趋势，从而辅助解释疾病发生发展的原因或规律；另一方面，本申请专利技术人经过研究，提供了一种适用于完整厚生物组织(280～480μm)高分辨成像的制片方法，该方法制得的玻片样本，一方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于完整厚生物组织高分辨成像的制片方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，取一块盖玻片放置在第一载物片上，用胶带覆盖所述的盖玻片和第一载物片；S2，挖去盖玻片区域范围内覆盖的胶带，暴露大部分盖玻片，使用疏水介质处理挖开区域的边缘；S3，将待观察的组织样品转移至盖玻片上，吸干样品液体，滴加抗荧光淬灭剂，静置1～3h后，再次吸干样品溶剂，滴加凝胶，使样品固定在盖玻片上；S4，取下盖玻片，放置在第二载物片上，使所述的组织样品位于盖玻片和第二载物片之间，通过胶带将盖玻片四周与第二载物片固定连接，完成制片。2.如权利要求1所述的用于完整厚生物组织高分辨成像的制片方法，其特征在于，所述的组织样品的厚度为280～480μm。3.如权利要求1所述的用于完整厚生物组织高分辨成像的制片方法，其特征在于，步骤S1中，根据组织样品的厚度，覆盖一层至多层胶带，所述的胶带的总厚度不超过组织样品的厚度。4.如权利要求1所述的用于完整厚生物组织高分辨成像的制片方法，其特征在于，步骤S2中，还包括：使用疏水介质将挖开区域内的盖玻片分成多个样品室。...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭媛媛，张瑞霖，刘海波，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院青浦分院上海市青浦区中心医院，
类型：发明
国别省市：