利用启动子工程提高鼠李糖脂产量的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用启动子工程提高鼠李糖脂产量的方法。研究发现采用启动子P

【技术实现步骤摘要】
利用启动子工程提高鼠李糖脂产量的方法


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，特别是涉及利用启动子工程提高鼠李糖脂产量的方法。

技术介绍

[0002]鼠李糖脂(Rhamnolipids,RL)是一种糖脂类的阴离子生物表面活性剂，鼠李糖基和β
‑
羟基脂肪酸分别组成其亲水基团和疏水基团，根据糖基数量分为单鼠李糖脂和双鼠李糖脂。RL具有乳化、增溶、降低表/界面张力、抗菌活性、促进伤口愈合等功能，这使得其在石油开采、医药、食品、日化及环境保护等领域都具有极大的应用潜力。
[0003]目前主要采用铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa的发酵培养获得RL，该宿主内含有RL合成的完整代谢途径。近年来，主要围绕发酵工艺优化和代谢工程改造提高RL产量，如：2010年，Markus Michael等人用葵花籽油作为碳源发酵培养P.aeruginosa DSM 7108，RL产量可达35.7g
·
L
–1，但产物得率Y
P/S
仅为0.278g
·
g
–1；2012年，Chukwudi O等人以葡萄糖为碳源发酵P.nitroreducens，RL产量可达5.5g
·
L
–1，Y
P/S
仅为0.137g
·
g
–1，发酵工艺优化虽能获得较高的产量，但存在Y
P/S
极低和发酵成本高的问题。为了降低成本，越来越多的研究者采用代谢工程策略提高RL产量，2019年，黄朝等人构建过表达rhlAB和rhlC基因的工程菌P.aeruginosa DN1，使得RL产量分别为野生型(WT)的1.18倍(16.75g
·
L
–1)和1.30倍(18.52g
·
L
–1)；2020年，Zhao feng等通过敲除psl和phaC1C2基因积累RL的合成前体，最优工程菌的RL产量仅为WT的1.70倍(21.40g
·
L
–1)。这些研究表明盲目的基因过表达或敲除并不能有效提高RL的产量，因为不恰当的基因过表达或敲除会影响菌体自身代谢平衡，进而降低鼠李糖脂产量，因此，这些研究尚未从根本上解决RL合成产量低的问题。

技术实现思路

[0004]鉴于以上所述现有技术的问题，本专利技术的目的在于提供一种利用启动子工程技术提高鼠李糖脂产量的方法及专用菌株，用于解决现有技术中鼠李糖脂生产效率低的问题。
[0005]本专利技术的另一方面提供了独立的rhlB基因在制备鼠李糖脂中的用途。
[0006]所述“独立的rhlB基因”是指单独使用rhlB基因用于提高鼠李糖脂的产量，而不与其他基因联合使用。
[0007]本专利技术的另一方面提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示启动子P
rpsJ
联合rhlB基因在制备鼠李糖脂中的用途。具体地，为利用启动子P
rpsJ
调节目的基因rhlB的转录。
[0008]本专利技术的另一方面提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示启动子P
rpsJ
在制备鼠李糖脂中的用途。
[0009]本专利技术的另一方面提供了一种基因片段，所述基因片段中含有核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示启动子P
rpsJ
与rhlB基因。
[0010]本专利技术的另一方面提供了一种重组质粒，所述重组质粒中含有如上所述的基因片段。
[0011]本专利技术的另一方面提供了一种生物工程菌，所述生物工程菌中含有如上所述的重组质粒。
[0012]进一步地，所述生物工程菌为重组大肠杆菌或重组铜绿假单胞菌。
[0013]本专利技术的另一方面提供了一种制备鼠李糖脂的方法，所述方法为利用核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示的启动子P
rpsJ
联合rhlB基因，转化至生物工程菌中发酵制备鼠李糖脂。
[0014]进一步地，所述方法包含以下步骤：
[0015]1)构建含有启动子P
rpsJ
和rhlB基因的重组质粒的生物工程菌；
[0016]2)培养生物工程菌并发酵，即可获得鼠李糖脂。
[0017]进一步地，所述生物工程菌为铜绿假单胞菌或者大肠杆菌。
[0018]研究发现，rhlB基因为利用工程菌制备鼠李糖脂的最核心和关键的基因，申请人也通过实验验证了将P
rpsJ
和rhlB基因转化至其它生物工程菌(例如大肠杆菌中)中发酵制备鼠李糖脂，同样获得了较好的效果。在优选的方案中为采用铜绿假单胞菌发酵制备鼠李糖脂。
[0019]如上所述，本专利技术利用启动子工程提高鼠李糖脂产量的方法，具有以下有益效果：
[0020]研究发现，采用启动子P
rpsJ
与rhlB基因联合，转化至铜绿假单胞菌中，可显著提高鼠李糖脂的产量。
附图说明
[0021]图1显示为基因调取凝胶电泳图
[0022]图2菌落PCR验证凝胶电泳图
[0023]图3不同基因过表达对鼠李糖脂产量的影响
[0024]图4rhlB
‑
MCS5质粒图谱
[0025]图5启动子和rhlB的基因调取凝胶电泳图
[0026]图6菌落PCR验证凝胶电泳图
[0027]图7P
rpsJ
‑
rhlB
‑
MCS5质粒图谱
[0028]图8不同启动子调控rhlB的重组铜绿假单胞菌的鼠李糖脂产量
具体实施方式
[0029]研究思路
[0030]鼠李糖脂合成机制复杂，主要涉及三大反应模块：(1)中心糖代谢途径：葡萄糖经糖酵异生或ED途径得到6
‑
磷酸
‑
葡萄糖，后者通过一系列代谢得到前体dTDP
‑
L
‑
鼠李糖；(2)脂肪酸的从头合成途径：乙酰
‑
CoA经脂肪酸从头合成途径得到前体β
‑
羟脂酰
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ACP；(3)鼠李糖脂关键酶级联反应：前体β
‑
羟脂酰
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ACP在3
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羟脂酰
‑
ACP O
‑3‑
羟脂酰
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转移酶(RhlA)催化下得到β
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羟基脂肪酸(HAA)，后者与一分子dTDP
‑
L
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鼠李糖在鼠李糖基转移酶I(RhlB)催化下得到单鼠李糖脂，单鼠李糖脂与一分子dTDP
‑
L
‑
鼠李糖在鼠李糖基转移酶II(RhlC)催化下生成双鼠李糖脂。
[0031]同时，RL的合成还受到群体响应系统的调控，主要包括las系统、rhl系统和pqs系统。其中LasI合成信号分子高丝氨酸内酯3OC
12
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.独立的rhlB基因在制备鼠李糖脂中的用途。2.核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示启动子P
rpsJ
联合rhlB基因在制备鼠李糖脂中的用途。3.核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示启动子P
rpsJ
在制备鼠李糖脂中的用途。4.一种基因片段，其特征在于：所述基因片段中含有核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示启动子P
rpsJ
与rhlB基因。5.一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒中含有如权利要求4所述的基因片段。6.一种生物工程菌，其特征在于：所述生物工程菌种含有如权利要求5所述的重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘亚菲，费一诺，耿文鑫，黄金钱，沈银涵，刘沛铭，
申请(专利权)人：常州药物研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：