精浆外泌体及其在促进胚胎着床或制备用于促进胚胎着床的制剂中的应用制造技术

本发明专利技术提供了精浆外泌体及其在促进胚胎着床或制备用于促进胚胎着床的制剂中的应用。与现有技术相对比，本发明专利技术具有以下优点：本申请提供的精浆外泌体及其在促进胚胎着床或制备用于促进胚胎着床的制剂中的应用，精浆外泌体能够促进子宫中免疫细胞向免疫耐受状态转化，促进母

【技术实现步骤摘要】
精浆外泌体及其在促进胚胎着床或制备用于促进胚胎着床的制剂中的应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及精浆外泌体及其在促进胚胎着床或制备用于促进胚胎着床的制剂中的应用。
技术背景
[0002]精液包括精子和精浆两大部分。精浆为精液去除精子后剩下的部分，精子由睾丸产生，长期以来认为精浆的主要功能只是保护精子，为精子提供能量和营养物质，作为输送精子的介质。但随着研究的深入，已有研究表明精浆除了传统的功能外，还具有提高子宫内膜容受性、促进免疫耐受型细胞增殖、提高胚胎移植成功率的作用；但具体的功能分子和作用机制不明，有部分报道是精浆中的一些蛋白的作用，但是没有阐明具体的机制。
[0003]外泌体(exosomes)是一种细胞分泌的囊性小泡，存在于各种体液中，例如血浆、唾液、精浆等，能携带脂质、蛋白质和遗传物质，外泌体具有重要的生物学功能，包括物质运输、细胞间通讯、细胞迁移、细胞分化和免疫调节。
[0004]胚胎对于母体来说，是一个半异体组织，易受母体排斥，只能在一个特定的时间段内(即“着床窗口期”)才能被母体子宫内膜组织接纳。胚胎着床过程的完成有赖于母体子宫与胚胎的同步发育、母体子宫内膜容受性和“着床窗口期”的形成、以及母体子宫组织局部免疫耐受性的形成，涉及细胞的增殖和分化、局部免疫功能的调节。因此子宫内膜容受性状态的形成是胚胎在子宫成功着床和正常发育的关键，其中以树突状细胞(DC)、调节性T细胞(Treg)为主的免疫细胞在子宫内形成的免疫耐受环境是子宫内膜容受性形成的基础。
[0005]现有研究中，与胚胎着床有关的因素还知之甚少，已有研究表明精浆具有调节子宫内膜容受性的作用，但是具体的调控分子和机制尚未清楚。而由于外泌体是一种具有免疫调节和信息传输作用的生物分子，若能够在胚胎着床期间利用精浆外泌体调节母
‑
胎间的免疫反应，促进子宫内膜容受性的形成，就能够达到有利于胚胎着床的目的。

技术实现思路

[0006]针对上述存在的拘束局限性，本专利技术提出了精浆外泌体及其在促进胚胎着床或制备用于促进胚胎着床的制剂中的应用，克服了
技术介绍
中提到的不足和缺陷。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：
[0008]本专利技术的专利技术点是提供一种外泌体，所述外泌体是来源于雄性动物精浆且通过超速离心法提取得到的精浆外泌体。
[0009]进一步的，上述的外泌体，所述精浆为来源于雄性动物储精囊、附睾和/或前列腺的精浆。
[0010]由于精浆已经去除了供体动物的精子，只保留了具有包含有内载物的外泌体，故此所述的精浆外泌体可以针对不同物种的受体动物，而不同物种的供体动物也同样可以跨物种的将其精浆外泌体提供给受体动物使用。
[0011]进一步的，上述的外泌体，所述精浆外泌体是将雄性动物的精液分离出精浆后，精浆分别经过低速、中速和高速离心后以滤膜过滤，再采用超速离心及缓冲液重悬的方式制备得到的。
[0012]精液分离出精浆是采用8000
‑
10000rpm的转速离心9
‑
11min；
[0013]低速、中速、高速离心是将精浆分别以450
‑
550g于3
‑
5℃离心4
‑
6min取上清，以2900
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3100g于3
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5℃离心24
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26min取上清，以9500
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10500g于3
‑
5℃离心55
‑
65min取上清；
[0014]以0.2
‑
0.24μm的滤膜过滤后，滤液以超速119500
‑
120500g于3
‑
5℃离心65
‑
75min，得到外泌体沉淀。
[0015]本专利技术的第二个专利技术点是提供了上述外泌体的制备方法，包括以下步骤：S1.将来源于雄性动物的精液以8000
‑
10000rpm的转速离心9
‑
11min，得到精浆；S2.步骤S1得到的精浆以450
‑
550g于3
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5℃离心4
‑
6min，得到上清液一；S3.步骤S2得到上清液一以2900
‑
3100g于3
‑
5℃离心24
‑
26min，得到上清液二；S4.步骤S3得到上清液二以9500
‑
10500g于3
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5℃离心55
‑
65min，得到上清液三；S5.步骤S4得到上清液三以0.2
‑
0.24μm的滤膜过滤后，得到滤液；S6.步骤S5得到的滤液以119500
‑
120500g于3
‑
5℃离心65
‑
75min，得到外泌体沉淀；S7.步骤S6得到的外泌体沉淀以PBS缓冲液重悬后，即可得到精浆外泌体，并以
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80℃保存。
[0016]S1中，优选为离心转速9000rpm，离心10min；
[0017]S2中，优选为离心转速500g，4℃离心5min；
[0018]S3中，优选为离心转速3000g，4℃离心25min；
[0019]S4中，优选为离心转速10000g，4℃离心60min；
[0020]S5中，优选为0.22μm的滤膜；
[0021]S6中，优选为离心转速120000g，4℃超离70min；
[0022]S7中，优选为0.01M的PBS缓冲液重悬。
[0023]本专利技术的第三个专利技术点是提供了上述的外泌体或上述的制备方法制备的外泌体在促进胚胎着床或制备用于促进胚胎着床的制剂中的应用。
[0024]进一步的，上述的应用，所述精浆外泌体的施用方式为阴道注射、腹腔注射或静脉注射，优选为雌性动物的阴道注射方式。
[0025]精浆中的蛋白如sCD38通过阴道注射，其他对怀孕有影响的蛋白，如LIF通过腹腔注射，TIGIT
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Fc通过静脉注射等等。
[0026]进一步的，上述的应用，所述精浆外泌体的阴道注射施用方式中，施用量按照体重计为每次每g体重注射0.1
‑
0.5μL的精浆外泌体。
[0027]进一步的，上述的应用，所述精浆外泌体的阴道注射施用方式中，施用时间为以交配当天计0.5d计算，在1.5d和3.5d分别注射1次。
[0028]进一步的，上述的应用，所述用于促进胚胎着床的制剂中，还包括有联用成分，所述联用成分为环孢素A、降钙素和单硝酸异山梨酯中的一种或多种。
[0029]环孢素A(CsA)是用于器官移植和自身免疫疾病的免疫抑制药物，其能够促进多种肿瘤细胞和非肿瘤细胞的迁移、侵袭和增殖功能。对人类早期妊娠的研究证实，CsA在诱导
母体对胚胎抗原产生免疫耐受的同时，促进妊娠50本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外泌体，其特征在于，所述外泌体是来源于雄性动物精浆且通过超速离心法提取得到的精浆外泌体。2.根据权利要求1所述的外泌体，其特征在于，所述精浆为来源于雄性动物储精囊、附睾和/或前列腺的精浆。3.根据权利要求1或2所述的外泌体，其特征在于，所述精浆外泌体是将雄性动物的精液分离出精浆后，精浆分别经过低速、中速和高速离心后以滤膜过滤，再采用超速离心及缓冲液重悬的方式制备得到的。4.根据权利要求1
‑
3任一所述的外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.将来源于雄性动物的精液以8000
‑
10000rpm的转速离心9
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11min，得到精浆；S2.步骤S1得到的精浆以450
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550g于3
‑
5℃离心4
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6min，得到上清液一；S3.步骤S2得到上清液一以2900
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3100g于3
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5℃离心24
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26min，得到上清液二；S4.步骤S3得到上清液二以9500
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10500g于3
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5℃离心55
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65min，得到上清液三；S5.步骤S4得到上清液三以0.2
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0.24μm的滤膜过滤后，得到滤液；S6.步骤S5得到的滤液以1195...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾科，孔艳，陈熹，胡欢欢，王延博，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：