一种冻带鱼致病菌污染模型的建立及应用制造技术

本发明专利技术属于冻带鱼致病菌检测技术领域，具体涉及一种冻带鱼致病菌污染模型的建立及应用。其建立方案为:取无污染冻带鱼接入致病菌，进行培养，冻干除去水分，加入甲醇提取，离心除去沉淀，过滤,进行LC

【技术实现步骤摘要】
一种冻带鱼致病菌污染模型的建立及应用


[0001]本专利技术属于冻带鱼致病菌检测
，尤其是涉及一种冻带鱼致病菌污染模型的建立及应用。

技术介绍

[0002]水产品死后易腐败变质，被致病菌污染。袁玉荣等对秦皇岛市水产品中致病菌监测结果进行了分析，沙门菌、单核增生李斯特菌、副溶血性弧菌在80份鲜冻水产品样品中检出率为31.3％(袁玉荣,丁秀萍.2005～2008年秦皇岛市水产品中致病菌监测结果及分析.中国卫生检验杂志,2009,19(8):1922
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1923.)；孙素梅等对北京市大兴区市售水产品中副溶血性弧菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、创伤弧菌4种致病菌的污染状况进行了检测，发现市售水产品致病菌污染严重，46件样本阳性率为34.78％(孙素梅,吴占国,周丽敏,等.北京市大兴区水产品致病菌监测结果分析.首都公共卫生,2013,7(1):35
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37.)；谢庆超等对东南沿海地区的92份生食水产品样品进行检测，致病菌总体检出率为41.30％(谢庆超,李想,赵勇,等.多重RT
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PCR快速检测东南沿海城市生食水产品中致病菌污染状况.检验检疫学刊,2017,27(4):1
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5)；李海麟等对2013～2020年广州市市售生食动物性水产品食源性致病菌监测结果进行了分析，结果发现食源性致病菌总检出率为14.26％，生食动物性淡水产品检出率较高，达到了45.70％，广州市市售生食动物性水产品存在不同程度的食源性致病菌污染，致病菌污染主要以创伤弧菌、副溶血性弧菌为主(李海麟,刘于飞,张维蔚,等.2013
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2020年广州市市售生食动物性水产品食源性致病菌监测结果分析.食品安全质量检测学报,2021,(12)8:3113
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3117.)。可见，近年来水产品被致病菌污染较严重，存在较高食品安全隐患。
[0003]带鱼(Trichiurus lepturus)为暖水性近底层鱼类，主要分布于中国、日本、印度尼西亚、菲律宾、印度等国的沿岸海域，是我国最重要的经济鱼类之一，每年的捕捞量为100万吨左右。带鱼被打捞后很快死亡，采用冷冻低温条件进行运输和贮藏，在这期间易受微生物影响，导致鱼肉发生腐败变质，因此带鱼致病菌检测一直受到重视。
[0004]专利技术人针对冻带鱼的致病菌检测进行研究，研究发现冻带鱼的常见致病菌为金黄葡萄球菌、沙门氏菌和副溶血弧菌这三种。而目前能快速检测的技术有分子生物学的聚合酶链式反应(PCR)，该PCR方法在检测时，当冻带鱼被金黄葡萄球菌、沙门氏菌和副溶血弧菌其中一种菌污染时，其检测出来的结果比较准确，但当冻带鱼被金黄葡萄球菌、沙门氏菌和副溶血弧菌同时污染时，其检测出来的结果易造成假阳性或假阴性。因此，为适应公共卫生事件应急处理、快速反应的需要，研发冻带鱼食源性致病菌的快速、高通量检测方法，对于加强冻带鱼食源性致病菌的监测和控制具有重要意义。

技术实现思路

[0005]根据以上现有技术中的不足，本专利技术要解决的技术问题是：提供一种冻带鱼致病菌污染模型的建立及应用，当冻带鱼同时被金黄葡萄球菌、沙门氏菌和副溶血弧菌三种菌
污染时，能准确性地进行判断。
[0006]本方案提供一种冻带鱼致病菌污染模型的建立，包括以下步骤：
[0007]步骤一、取未被金黄葡萄球菌、沙门氏菌和副溶血弧菌污染的冻带鱼进行解冻，解冻后接入致病菌，得到污染后的冻带鱼，所述致病菌由金黄葡萄球菌、沙门氏菌和副溶血弧菌组成；
[0008]步骤二、对所述污染后的冻带鱼进行培养，得到培养后的冻带鱼；
[0009]步骤三、对所述培养后的冻带鱼进行冻干处理，除去水分，得到冻干的冻带鱼；
[0010]步骤四、在所述冻干的冻带鱼中加入有机溶剂并提取，得提取液；
[0011]步骤五、对所述提取液进行离心处理，除去沉淀，要上清液，对上清液进行过滤，要滤液；
[0012]步骤六、对步骤五中的滤液进行LC
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MS检测，再对检测结果进行代谢组学分析，得到污染代谢标志物，污染模型建立完成。
[0013]同时本方案还提供了冻带鱼致病菌污染模型的应用，包括以下步骤：
[0014]第一步、取市售冻带鱼，进行冻干处理，除去水分，得到冻干的待检测样品；
[0015]第二步、在所述冻干的待检测样品中加入甲醇并提取，得待检测提取液；
[0016]第三步、对所述待检测提取液进行离心处理，除去沉淀，要上清液，对上清液进行过滤，要滤液，得到待检测滤液；
[0017]第四步、对待检测滤液进行LC
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MS检测，再对检测结果进行代谢组学分析，得代谢物；
[0018]第五步、判断代谢物是否与污染模型代谢标志物相符，如相符则说明市售冻带鱼被金黄葡萄球菌、沙门氏菌和副溶血弧菌交叉污染。
[0019]通过上述方法的对比检测，可以同时对金黄葡萄球菌、沙门氏菌和副溶血弧菌交叉污染进行检测，有效地提高了冻带鱼致病菌的检测效率。
[0020]进一步，优选冻带鱼致病菌污染模型的建立的所述步骤四中加入溶剂后采用超声提取，得所述提取液。采用超声提取，可以加快代谢物溶出。
[0021]进一步，优选冻带鱼致病菌污染模型的建立的所述步骤四中的溶剂为甲醇、乙醇、乙腈或甲醇与乙腈混合液(1:1)中的一种。
[0022]进一步，优选冻带鱼致病菌污染模型的建立的所述步骤四中的溶剂为甲醇，每0.1g冻干带鱼加入1.5mL甲醇进行提取。因为甲醇极性与大部分代谢物相似，有利于代谢物溶解。
[0023]进一步，优选冻带鱼致病菌污染模型的建立的所述步骤五中的过滤采用微孔滤膜，微孔滤膜为0.22μm的有机系滤膜。采用本微孔滤膜能更好的截留溶液中的胶体颗粒和悬浮微粒，防止堵塞液相柱子。
[0024]进一步，优选冻带鱼致病菌污染模型的建立的所述步骤六中的污染代谢标志物为：Creatine、Hypoxanthine、L(
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)
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Carnitine、Adenine、Palmitoyl ethanolamide、Nicotinic acid、Bis(2
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ethylhexyl)phthalate、4
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Dodecylbenzenesulfonic acid、Creatinine、5'
‑
S
‑
Methyl
‑
5'
‑
thioadenosine、Myristyl sulfate、Adenosine、Dodecyl sulfate、DL
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Dipalmitoylphosphatidylcholine、Nervonic acid。
[0025]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0026]本设计方案由金黄葡萄球菌、沙门氏菌和副溶血弧菌组合后的混合致病菌对冻带鱼进行污染，建立冻带鱼致病菌交叉污本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种冻带鱼致病菌污染模型的建立，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、取未被金黄葡萄球菌、沙门氏菌和副溶血弧菌污染的冻带鱼进行解冻，解冻后接入致病菌，得到污染后的冻带鱼，所述致病菌由金黄葡萄球菌、沙门氏菌和副溶血弧菌组成；步骤二、对所述污染后的冻带鱼进行培养，得到培养后的冻带鱼；步骤三、对所述培养后的冻带鱼进行冻干处理，除去水分，得到冻干的冻带鱼；步骤四、在所述冻干的冻带鱼中加入有机溶剂并提取，得提取液；步骤五、对所述提取液进行离心处理，除去沉淀，要上清液，对上清液进行过滤，要滤液；步骤六、对步骤五中的滤液进行LC
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MS检测，再对检测结果进行代谢组学分析，得到污染代谢标志物，污染模型建立完成。2.根据权利要求1所述冻带鱼致病菌污染模型的建立，其特征在于：所述步骤四中加入溶剂后采用超声提取，得所述提取液。3.根据权利要求1或2所述冻带鱼致病菌污染模型的建立，其特征在于：所述步骤四中的溶剂为甲醇、乙醇、乙腈或甲醇与乙腈混合液(1:1)中的一种。4.根据权利要求1所述冻带鱼致病菌污染模型的建立，其特征在于：所述步骤五中过滤采用微孔滤膜，微孔滤膜为0.22μm的有机系滤膜。5.根据权利要求1所述冻带鱼致病菌污染模型的建立，其特征在于：所述步骤六中的污染代谢标志物为：Creatine、Hypoxanthine、L(
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)
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Carnitine、Adenine、Palmitoyl ethanolamide、...

【专利技术属性】
技术研发人员：祝子坪，李娜，李钧敏，童应鹏，
申请(专利权)人：台州学院，
类型：发明
国别省市：