用于疫苗开发的经修饰的mRNA制造技术

本发明专利技术的经修饰的信使RNA(mRNA)在其ORF内编码抗原例如病毒蛋白质、此类病毒蛋白质的在免疫原性方面有活性的部分或者抗癌蛋白质或表位，并且在至少一个核苷酸中包含炔烃或叠氮化物修饰中的至少一种。由本发明专利技术的mRNA所编码的一种优选的病毒蛋白质为冠状病毒蛋白质，尤其是SARS

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于疫苗开发的经修饰的mRNA
[0001]本专利技术涉及经炔烃或叠氮化物修饰的信使RNA(mRNA)，其在其ORF内编码抗原例如病毒蛋白质、此类病毒蛋白质的在免疫原性方面有活性的部分或者抗癌蛋白质或表位。本专利技术进一步涉及用于产生此类经修饰的mRNA的方法，用于产生和/或递送所述经修饰的mRNA的试剂盒，包含经修饰的mRNA的药学组合物，以及此类经修饰的mRNA的用途。用于针对抗原，尤其是病毒感染(例如由SARS
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CoV
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2所引起的病毒感染)进行疫苗接种的方法是本专利技术的一个进一步的、尤其是重要的方面。所述疫苗接种方法的第二个重要部分是使用免疫应答刺激试剂，特别是用于刺激干扰素基因刺激物(Stimulator of interferon genes；STING)受体的激动剂。
[0002]专利技术背景
[0003]关于冠状病毒流行/大流行的当前问题是表面蛋白质(刺突蛋白(S)和膜糖蛋白(M))的高度可变性，这导致甚至在进入机制和与表面受体结合方面的变化。其次，分别在表面蛋白质S和M中在冠状病毒毒株中的高突变率或该可变性导致新的冠状病毒，并且由此导致甚至在第一次感染后逃避免疫系统。这些问题导致通常的疫苗开发计划的失败。另一方面，大多数冠状病毒毒株不引起严重的疾病，这使得疫苗接种计划被废止。但是，SARS、MERS和现在的COVID
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19由高度危险的病毒毒株引起，并且在COVID
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19的情况下还是容易传播的。
[0004]对于病毒感染的免疫应答以下列三个步骤为特征：
[0005]1.通过补体系统的初始应答(＝先天免疫应答)；
[0006]2.受体介导的免疫应答，其导致中和抗体形成(IgA和IgG)；
[0007]3.在大多数情况下，引起T
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细胞介导的应答，从而根除被感染的细胞。
[0008]后两个免疫应答步骤通常也导致记忆免疫细胞，从而赋予终生免疫原性。
[0009]由于正常的疫苗开发(减毒或灭活病毒)在SARS和MERS疫苗开发中失败了，因而它很可能在COVID
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19免疫接种开发中也将会失败。
[0010]因此，本专利技术的目标是开发出用于提供疫苗的新方法，所述疫苗能够针对COVID
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19病毒感染对个体有效地进行免疫接种，但是也提供了使疫苗容易地适应于未来可能出现的其他病毒和攻击的选项。
[0011]信使RNA(mRNA)是模板分子，其在生物体的细胞中，从细胞DNA转录，并且在核糖体处翻译成氨基酸序列即蛋白质。为了控制所编码的蛋白质的表达水平，mRNA具有非翻译区(UTR)，其位于包含编码所述氨基酸序列的遗传信息的实际的开放读码框(ORF)的侧翼。此类UTR(分别称为5
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UTR和3
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UTR)是位于起始密码子之前和终止密码子之后的mRNA的节段。进一步地，mRNA包含poly(A)尾区，其是长的腺嘌呤核苷酸序列，其促进mRNA从细胞核中输出、翻译和在一定程度上保护mRNA免于降解。
[0012]由于其化学和生物化学特性，mRNA通常在细胞之内在几分钟内就降解了，因此特定蛋白质的表达通常是一个瞬时过程。此外，聚阴离子mRNA分子不是很好地适合于穿过细胞膜，这使得mRNA的外部递送极其困难。
[0013]尽管存在这些与mRNA相关联的挑战，但是近年的科学和技术进展已使得mRNA成为
关于新药物类别的有希望的候选物。Sahin U.等人,Nat.Publ.Gr.13,759
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780(2014)提供了关于基于mRNA的治疗学和药物开发的概览。例如，将mRNA用于触发蛋白质例如抗体和酶的体内产生，或者刺激免疫应答，例如通过表达特定表位或经由朝向结构mRNA部分的先天免疫应答。例如，RIG
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1结合RNA的5
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三磷酸末端并且触发信号级联，其导致转录因子的激活和细胞因子的释放(作为抗病毒应答的部分)。应用mRNA以刺激免疫应答可以在用于治疗癌症、AIDS和用于生成针对几乎任何疾病的疫苗的新方法中进行使用(参见Pardi,N.等人,Nat.Publ.Gr.543,248
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251(2017)；和Schlake T.等人,RNA Biol.9,1319
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30(2012))。这些令人兴奋的发展的关键是稳固地在体外产生具有经改善的翻译效率的经稳定的mRNA以及使用特定的转染制剂将其递送入细胞中。
[0014]图1a)显示了来自A.Wadhwa等人,Pharmaceutics 2020,12(2)并且由baseclick GmbH进行了改进以使与LNP承载体递送(图1b))的差异可见的描绘图，其代表了mRNA疗法背后的指导性原理，所述mRNA疗法基于提供体外转录的mRNA作为遗传信息的承载体，因此允许生物体发展其自身的治愈。在疫苗接种中，使用编码特定抗原的mRNA来生成免疫应答。
[0015]mRNA稳定性和翻译效率取决于几个因素。尤其地，在mRNA的任一末端处的非翻译区发挥关键作用。在真核生物蛋白质表达中，在5
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末端处的帽结构和在3
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末端处的poly(A)尾两者都增加mRNA稳定性并且增强蛋白质表达。另外，5
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UTR包含翻译所必需的核糖体结合位点，和3
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UTR包含采取改善稳定性并影响翻译的二级结构的RNA序列。此外，可以掺入经修饰的天然核苷酸(例如N1
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甲基假尿苷)和人工核苷酸以改善mRNA稳定性并且增强mRNA的翻译(Svitkin Y.V.等人,Nucleic Acids Research,第45卷,第10期,6023
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6036(2017))。
[0016]mRNA向细胞中的递送可以通过提供包含用于与细胞膜相融合的脂质和用于中和寡核苷酸主链的负电荷的阳离子的混合物来实现。已创建了特定制剂来优化mRNA递送并且赋予足够的体内稳定性以用于临床试验。大多数的静脉内应用的mRNA制剂被肝细胞吸收并且在肝细胞内表达。这是由于肝脏在脂肪酸代谢中发挥主要作用，并且因此mRNA制剂的高脂质含量展示出器官特异性靶向效应。但是，在大多数情况下，肝脏不是所希望的靶标，并因此进行努力来修饰脂质制剂以靶向牵涉免疫应答的器官，例如脾脏(Kranz L.M.等人,Nature 534,396
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401(2016))。备选地，可以从患者的血液中分离出免疫系统的细胞(例如，淋巴细胞)，并且离体进行mRNA应用以允许进行靶向。最近，已经公开了使用经抗体片段修饰的脂质制剂的mRNA的组织特异性靶向(Moffett H.F.等人,Nat.Commun.8,389(2017))。
[0017]尽管有关于mRNA的治疗可应用性(直接地或间接地，即通过离体转染细胞并且将此类经转染的细胞返回至患者)的早期进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.经修饰的信使RNA(mRNA)，其在其ORF内编码抗原例如病毒蛋白质、此类病毒蛋白质的在免疫原性方面有活性的部分或者抗癌蛋白质或表位，其特征在于，所述经修饰的mRNA在至少一个核苷酸中包含炔烃或叠氮化物修饰中的至少一种，并且所述经修饰的mRNA包含至少一个通过所述经修饰的mRNA与相应地经修饰的含炔烃或叠氮化物的功能分子的点击反应而引入的功能分子，所述功能分子为细胞特异性靶向基团或配体，其靶向免疫感受态细胞，特别是MHC1肽呈递细胞。2.根据权利要求1的经修饰的mRNA，其中所述病毒蛋白质为冠状病毒蛋白质，优选地冠状病毒核蛋白，最优选地SARS
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CoV
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2的核蛋白N和包膜蛋白E之一或两者。3.根据权利要求1或2的经修饰的mRNA，其包含5
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帽结构、5
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非翻译区(5
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UTR)、开放读码框区(ORF)、3
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非翻译区(3
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UTR)和poly(A)尾区，其特征在于，所述经修饰的mRNA在ORF、5
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UTR、3
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UTR和poly(A)尾区中的至少一个内的至少一个核苷酸中包含炔烃或叠氮化物修饰中的至少一种。4.根据权利要求1至3中任一项的经修饰的mRNA，其特征在于，所述经修饰的mRNA在下列部分中包含经修饰的核苷酸：a)ORF和UTR，b)ORF、UTR和poly(A)尾，或c)仅poly(A)尾。5.根据权利要求1至4中任一项的经修饰的mRNA，其中四种标准类型的核苷酸(AMP、CMP、GMP、UMP)中的至少一种是部分地或全部地经修饰的，例如在尿嘧啶或腺嘌呤处经乙炔基、乙烯基、四嗪、叠氮基修饰的，优选地在尿嘧啶或腺嘌呤处经乙炔基或叠氮基修饰的。6.根据权利要求1至5中任一项的经修饰的mRNA，其中至少一个核苷酸是经炔烃修饰的，并且至少一个核苷酸是经叠氮化物修饰的。7.根据前述权利要求中任一项的经修饰的mRNA，其中四种标准类型的核苷酸中的至少一种以经修饰的形式相比于未修饰的形式按1:100至10:1，优选地1:10至1:10或1:1的比例存在。8.根据前述权利要求中任一项的经修饰的mRNA，其特征在于，所述经修饰的mRNA包含以其他方式进行修饰的天然或人工核苷酸，优选地乙烯基尿苷、假尿苷或N1
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甲基假尿苷。9.根据前述权利要求中任一项的经修饰的mRNA，其中所述经修饰的mRNA包含另外的通过所述经修饰的mRNA与相应地经修饰的含炔烃或叠氮化物的功能分子的点击反应而引入的功能分子。10.根据权利要求9的经修饰的mRNA，其中所述另外的功能分子为增加所述mRNA的半寿期、增强所述mRNA的表达或者充当佐剂的物质。11.根据权利要求1至10中任一项的经修饰的mRNA，其中所述功能分子为糖部分、脂肪酸部分、细胞类型特异性抗体或此类抗体的片段，尤其是抗
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CD20或抗

【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：贝瑟克里科有限公司，
类型：发明
国别省市：