募集DNA聚合酶用于模板化编辑制造技术

本发明专利技术涉及重组核酸构建体，其包含序列特异性DNA结合蛋白、DNA依赖性DNA聚合酶和DNA编码的修复模板，任选地DNA核酸内切酶或其中序列特异性DNA结合蛋白包含DNA核酸内切酶活性，以及其用于修饰细胞和生物体中的核酸的使用方法。方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】募集DNA聚合酶用于模板化编辑
[0001]关于序列表的电子申请的声明
[0002]提供了ASCII文本格式的序列表来代替纸质副本，该序列表根据37 C.F.R.
§
1.821提交，命名为1499.14.WO_ST25.txt，大小为435,310字节，生成于2021年1月6日，并通过EFS
‑
Web提交。此序列表就其公开内容在此通过引用并入说明书中。
[0003]优先权声明
[0004]此申请根据35 U.S.C.
§
119(e)要求2019年1月6日提交的美国临时申请号62/957,542的权益，其全部内容通过引用并入本文。


[0005]本专利技术涉及重组核酸构建体，其包含序列特异性DNA结合蛋白、DNA依赖性DNA聚合酶和DNA编码的修复模板，任选地DNA核酸内切酶或其中序列特异性DNA结合蛋白包含DNA核酸内切酶活性，以及其用于修饰细胞和生物体中的核酸的使用方法。

技术介绍

[0006]精确的模板化编辑通常涉及在靶位点中引入双链断裂(DSB)并提供具有要掺入的所需编辑的模板。从编辑模板到靶位点的序列掺入依赖于通过同源重组途径对DSB进行模板修复，这不是大多数真核细胞中DNA修复的主要途径。此外，内源同源重组途径是具有多个步骤的复杂的过程，每个步骤都有固有的瓶颈，可能难以操作。总体而言，同源重组介导的模板化编辑效率在人类细胞中通常较低，在植物细胞中甚至更低，因为试剂递送效率低并且难以恢复编辑过的植物。
[0007]除酵母外，真核生物中最好的模板化编辑效率已在人类细胞培养中实现，其中试剂混合物(例如DNA核酸内切酶或切口酶、修复模板、NHEJ抑制剂、HDR刺激剂)的递送可以很容易地协调并具有高效率。具体来说，在人类细胞中，精确的模板化编辑已使用以下三种成分的复合物进行了证明：1)切口酶，它可以被引导RNA募集到序列特异性位点；2)具有扩展序列的引导RNA，它与切口DNA的3'结合并编码具有所需编辑的修复模板；和3)与切口酶融合的RNA依赖性DNA聚合酶(逆转录酶)，它使用切口DNA的3'端和引物来合成DNA(例如，掺入编辑)。在某些人类细胞类型中，已报道高达50％的精确模板化编辑(Anzalone等人Nature 576:149
–
157(2019))。
[0008]与人类细胞不同，在植物中，递送多种不同成分的试剂可能很困难。递送高剂量的修复模板也可能很困难，这可以通过增加细胞中修复模板的可用性来提高模板化编辑效率。迄今为止，植物中大多数模板化编辑成功是通过DNA表达盒和修复模板的粒子轰击实现的。最佳编辑效率低于10％，许多研究低于1％。报道的最高效率通常仅在基因组中的特定修复位点，对可能导致更高效率HDR的机制没有了解或了解甚少。

技术实现思路

[0009]本专利技术的一个方面提供了第一复合物，其包括：(a)第一序列特异性DNA结合蛋白，
其能够与靶核酸上的第一位点结合；和(b)第一DNA依赖性DNA聚合酶。
[0010]本专利技术的第二方面提供了第一复合物，其包括：(a)第一序列特异性DNA结合蛋白，其能够与靶核酸上的第一位点结合并且包含能够引入单链切口或双链断裂的核酸内切酶活性；(b)第一DNA依赖性DNA聚合酶；和(c)第一DNA编码的修复模板。
[0011]本专利技术的第三方面提供了第一复合物，其包括：(a)第一序列特异性DNA结合蛋白，其能够与靶核酸上的第一位点结合；(b)第一DNA依赖性DNA聚合酶；(c)第一DNA核酸内切酶；和(d)第一DNA编码的修复模板。
[0012]本专利技术的第四方面提供了第二复合物，其包括：(a)第二序列特异性DNA结合蛋白，其能够结合靶核酸上的第二位点；和(b)DNA编码的修复模板。
[0013]本专利技术的第五方面提供了一种工程化的(修饰的)DNA依赖性DNA聚合酶，其融合到能够与肽标签或RNA募集基序相互作用的亲和多肽。
[0014]本专利技术的第六方面提供了一种RNA分子，其包含(a)介导与CRISPR
‑
Cas效应蛋白相互作用的核酸序列；(b)通过DNA
‑
RNA相互作用将CRISPR
‑
Cas效应蛋白引导至特定核酸靶位点的核酸序列，和(c)形成可以与本专利技术的工程化的DNA依赖性DNA聚合酶相互作用的茎环结构的核酸序列。
[0015]本专利技术的第七方面提供修饰靶核酸的方法，所述方法包括使靶核酸接触：本专利技术的第一复合物，从而修饰靶核酸。
[0016]本专利技术的第八方面提供了修饰靶核酸的方法，所述方法包括使靶核酸接触：(a)第一序列特异性DNA结合蛋白，其能够结合靶核酸上的第一位点；(b)第一DNA依赖性DNA聚合酶；(c)第一DNA核酸内切酶；和(d)第一DNA编码的修复模板，从而修饰靶核酸。
[0017]本专利技术的第九方面提供了修饰靶核酸的方法，所述方法包括使靶核酸接触：(a)第一序列特异性DNA结合蛋白，其能够结合靶核酸上的第一位点并且包含能够引入单链切口或双链断裂的切口酶活性和/或核酸内切酶活性；(b)第一DNA依赖性DNA聚合酶；和(c)第一DNA编码的修复模板，从而修饰靶核酸。
[0018]本专利技术的第十方面提供了用于修饰靶核酸的系统，该系统包括本专利技术的第一复合物、编码该复合物的多核苷酸和/或包含该多核苷酸的表达盒或载体，其中(a)包含DNA核酸内切酶活性的第一序列特异性DNA结合蛋白与靶核酸上的第一位点结合；(b)第一DNA依赖性DNA聚合酶能够与第一序列特异性DNA结合蛋白相互作用，并被募集到第一序列特异性DNA结合蛋白和靶核酸上的第一位点，和(c)(i)第一DNA编码的修复模板连接至第一引导核酸，所述第一引导核酸包含与靶核酸上的第一位点具有基本互补性的间隔序列，从而将第一DNA编码的修复模板引导至靶核酸上的第一位点或(c)(ii)第一DNA编码的修复模板能够与第一序列特异性DNA结合蛋白或第一DNA依赖性DNA聚合酶相互作用，并被募集到第一序列特异性DNA结合蛋白或第一DNA依赖性DNA聚合酶和靶核酸上的第一位点，从而修饰靶核酸。
[0019]本专利技术的第十一方面提供了用于修饰靶核酸的系统，该系统包括本专利技术的第一复合物、编码该复合物的多核苷酸和/或包含该多核苷酸的表达盒或载体，其中(a)第一序列特异性DNA结合蛋白与靶核酸上的第一位点结合，(b)第一DNA核酸内切酶能够与第一序列特异性DNA结合蛋白和/或引导核酸相互作用，并被募集到第一序列特异性DNA结合蛋白和靶核酸上的第一位点；(c)第一DNA依赖性DNA聚合酶能够与第一序列特异性DNA结合蛋白
和/或引导核酸相互作用，并被募集到第一序列特异性DNA结合蛋白和靶核酸上的第一位点；和(d)(i)第一DNA编码的修复模板与包含与靶核酸上的第一位点基本互补的间隔序列的引导核酸连接，从而将第一DNA编码的修复模板引导至靶核酸上的第一位点，或(d)(ii)第一DNA编码的修复模板能够与第一序本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.第一复合物，包括：(a)第一序列特异性DNA结合蛋白，其能够结合靶核酸上的第一位点；和(b)第一DNA依赖性DNA聚合酶。2.权利要求1所述的第一复合物，还包含第一DNA编码的修复模板。3.权利要求1或权利要求2所述的第一复合物，进一步包括第一DNA核酸内切酶，其中所述DNA核酸内切酶能够引入单链切口或双链断裂，或者能够结合靶核酸上的第一位点的第一序列特异性DNA结合蛋白还包含能够引入单链切口或双链断裂的核酸内切酶活性。4.第一复合物，包括：(a)第一序列特异性DNA结合蛋白，其能够结合靶核酸上的第一位点并且包含能够引入单链切口或双链断裂的核酸内切酶活性；(b)第一DNA依赖性DNA聚合酶；和(c)第一DNA编码的修复模板。5.第一复合物，包括：(a)第一序列特异性DNA结合蛋白，其能够结合靶核酸上的第一位点；(b)第一DNA依赖性DNA聚合酶；(c)第一DNA核酸内切酶；和(d)第一DNA编码的修复模板。6.权利要求1至5中任一项所述的第一复合物，其中所述第一序列特异性DNA结合蛋白来自多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR
‑
Cas效应蛋白、蛋白质引导的核酸内切酶(例如，锌指核酸酶)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和/或Argonaute蛋白。7.权利要求3至6中任一项所述的第一复合物，其中所述第一DNA核酸内切酶是核酸内切酶(例如，Fok1)、多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR
‑
Cas效应蛋白、蛋白质引导的核酸内切酶(例如，锌指核酸酶)和/或转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)。8.权利要求3至7中任一项所述的第一复合物，其中所述第一DNA核酸内切酶是核酸酶或切口酶。9.权利要求1至8中任一项所述的第一复合物，还包含引导核酸(例如，crRNA、crDNA)。10.权利要求1、2或6至9中任一项所述的第一复合物，其中所述第一序列特异性DNA结合蛋白包含核酸内切酶或切口酶活性。11.权利要求10所述的第一复合物，其中所述第一序列特异性DNA结合蛋白的核酸内切酶或切口酶活性来自多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR
‑
Cas效应蛋白、蛋白质引导的核酸内切酶(例如，锌指核酸酶)和/或转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)。12.权利要求1至11中任一项所述的第一复合物，其中所述第一序列特异性DNA结合蛋白任选地通过接头(在其N
‑
末端或C
‑
末端)融合至所述第一DNA依赖性DNA聚合酶。13.权利要求1至12中任一项所述的第一复合物，其中所述第一DNA依赖性DNA聚合酶表现出高保真度和/或高持续合成能力。14.权利要求1至12中任一项所述的第一复合物，其中所述第一DNA依赖性DNA聚合酶表现出高分布谱。15.权利要求1至14中任一项所述的第一复合物，其中所述第一DNA依赖性DNA聚合酶包含3
’‑5’
核酸外切酶活性、5
’‑3’
核酸外切酶活性和/或5
’‑3’
RNA依赖性DNA聚合酶活性。
16.权利要求15所述的第一复合物，其中第一DNA依赖性DNA聚合酶被修饰以去除3
’‑5’
核酸外切酶活性、5
’‑3’
核酸外切酶活性和5
’‑3’
RNA依赖性DNA聚合酶活性中的一个或多个。17.权利要求1至16中任一项所述的第一复合物，其中所述第一DNA依赖性DNA聚合酶包含Klenow片段或其子片段。18.权利要求1至17中任一项所述的第一复合物，其中所述第一DNA依赖性DNA聚合酶融合至序列非特异性DNA结合蛋白。19.权利要求18所述的第一复合物，其中所述序列非特异性dsDNA结合蛋白来自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的Sso7d。20.权利要求1至19中任一项所述的第一复合物，其中所述第一DNA依赖性DNA聚合酶是来自人、酵母、细菌或植物的DNA依赖性DNA聚合酶。21.权利要求1至19中任一项所述的第一复合物，其中所述第一DNA依赖性DNA聚合酶是DNA聚合酶ε(例如，人和酵母)、DNA聚合酶δ、大肠杆菌聚合酶I、DNA聚合酶、DNA聚合酶、DNA聚合酶、Deep DNA聚合酶、DeepDNA聚合酶、9
°
Nm
TM
DNA聚合酶、DNA聚合酶、DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶和/或Phire
TM
DNA聚合酶。22.权利要求1至20中任一项所述的第一复合物，其中所述第一DNA聚合酶是人DNA依赖性DNA聚合酶ε、植物DNA依赖性DNA聚合酶ε和/或酵母DNA依赖性DNA聚合酶ε。23.权利要求1至22中任一项所述的第一复合物，其中所述第一DNA依赖性DNA聚合酶是分布性聚合酶。24.权利要求1至23中任一项所述的第一复合物，其中所述第一序列特异性DNA结合蛋白融合至肽标签，并且所述第一DNA依赖性DNA聚合酶融合至能够结合所述肽标签的亲和多肽，从而将所述第一DNA依赖性DNA聚合酶募集到与所述肽标签融合的所述第一序列特异性DNA结合蛋白。25.权利要求1至23中任一项所述的第一复合物，其中所述第一DNA依赖性DNA聚合酶融合至肽标签，并且所述第一序列特异性DNA结合蛋白融合至能够结合所述肽标签的亲和多肽，从而将所述第一DNA依赖性DNA聚合酶募集到与所述亲和多肽融合的所述第一序列特异性DNA结合蛋白。26.权利要求24或25所述的第一复合物，其中所述肽标签包括GCN4肽标签(例如Sun
‑
标签)、c
‑
Myc亲和标签、HA亲和标签、His亲和标签、S亲和标签、甲硫氨酸
‑
His亲和标签、RGD
‑
His亲和标签、FLAG八肽、strep标签或strep标签II、V5标签和/或VSV
‑
G表位。27.权利要求24至26中任一项所述的第一复合物，其中所述亲和多肽是抗体，任选地是scFv抗体、亲和体、anticalin、单体(monobody)和/或DARPin。28.权利要求9至23中任一项所述的第一复合物，其中所述引导核酸与RNA募集基序连接，并且所述第一DNA依赖性DNA聚合酶与能够结合所述RNA募集基序的亲和多肽融合。29.权利要求28所述的第一复合物，其中所述RNA募集基序与所述CRISPR核酸(例如募集crRNA、募集crDNA)的5'端或3'端连接。30.权利要求28或29所述的第一复合物，其中所述RNA募集基序和相应的亲和多肽是端
粒酶Ku结合基序(例如，Ku结合发夹)和Ku的亲和多肽(例如，Ku异二聚体)；端粒酶Sm7结合基序和Sm7的亲和多肽；MS2噬菌体操纵子茎环和亲和多肽MS2外壳蛋白(MCP)、PP7噬菌体操纵子茎环和亲和多肽PP7外壳蛋白(PCP)；SfMu噬菌体Com茎环和亲和多肽Com RNA结合蛋白；PUF结合位点(PBS)和亲和多肽Pumilio/fem
‑
3mRNA结合因子(PUF)；和/或合成的RNA适配体和相应的适配体配体。31.权利要求28或权利要求29所述的第一复合物，其中所述RNA募集基序和相应的亲和多肽是MS2噬菌体操纵子茎环和亲和多肽MS2外壳蛋白(MCP)，和/或PUF结合位点(PBS)和亲和多肽Pumilio/fem
‑
3mRNA结合因子(PUF)。32.权利要求9至31中任一项所述的第一复合物，其中所述第一DNA编码的修复模板与所述引导核酸连接。33.权利要求1至32中任一项所述的第一复合物，其中所述第一DNA结合结构域和/或第一DNA核酸内切酶是CRISPR
‑
Cas效应蛋白。34.权利要求33所述的第一复合物，其中所述CRISPR
‑
Cas效应蛋白来自I型CRISPR
‑
Cas系统、II型CRISPR
‑
Cas系统、III型CRISPR
‑
Cas系统、IV型CRISPR
‑
Cas系统或V型CRISPR
‑
Cas系统。35.权利要求33所述的第一复合物，其中所述CRISPR
‑
Cas效应蛋白来自II型CRISPR
‑
Cas系统或V型CRISPR
‑
Cas系统。36.权利要求34或权利要求35所述的第一复合物，其中所述V型CRISPR
‑
Cas效应蛋白是Cas12a、Cas12b、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12g、Cas12h、Cas12i、C2c1、C2c4、C2c5、C2c8、C2c9、C2c10、Cas14a、Cas14b和/或Cas14c。37.权利要求33至34中任一项所述的第一复合物，其中所述CRISPR
‑
Cas效应蛋白是Cas9效应蛋白或Cas12效应蛋白。38.第二复合物，包括：(a)第二序列特异性DNA结合蛋白，其能够结合靶核酸上的第二位点；和(b)DNA编码的修复模板。39.权利要求38所述的第二复合物，其中所述第二序列特异性DNA结合蛋白来自多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR
‑
Cas效应蛋白、蛋白质引导的核酸内切酶(例如，锌指核酸酶)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和/或Argonaute蛋白。40.权利要求39所述的第二复合物，进一步包含第二DNA核酸内切酶，其中所述第二DNA核酸内切酶能够引入单链切口或双链断裂。41.权利要求40所述的第二复合物，其中所述第二DNA核酸内切酶来自多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR
‑
Cas效应蛋白、蛋白质引导的核酸内切酶(例如，锌指核酸酶)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)。42.权利要求38或权利要求39所述的第二复合物，其中能够结合靶核酸上的第二位点的第二序列特异性DNA结合蛋白还包含能够引入单链切口或双链断裂的核酸内切酶活性。43.权利要求42所述的第二复合物，其中进一步包含核酸内切酶活性的所述第二序列特异性DNA结合蛋白是多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR
‑
Cas效应蛋白、蛋白质引导的核酸内切酶(例如，锌指核酸酶)，或转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)。44.权利要求38至43中任一项所述的第二复合物，还包含第二DNA依赖性DNA聚合酶。
45.权利要求38至43中任一项所述的第二复合物，其中所述第二DNA编码的修复模板连接至DNA募集基序，并且所述第二序列特异性DNA结合蛋白融合至亲和多肽，所述亲和多肽能够与DNA募集基序相互作用，任选地其中所述DNA募集基序/亲和多肽包含HUH
‑
标签、DNA适配体、细菌反转录子的msDNA或T
‑
DNA募集。46.权利要求38至45中任一项所述的第二复合物，其中所述第二序列特异性DNA结合蛋白(在其N
‑
末端或C
‑
末端)融合至猪圆环病毒2(PCV)Rep蛋白并且DNA模板包含PCV识别位点。47.权利要求38至46中任一项所述的第二复合物，其中所述第二DNA编码的修复模板与引导核酸连接。48.一种工程化的(修饰的)DNA依赖性DNA聚合酶，其融合至能够与肽标签或RNA募集基序相互作用的亲和多肽。49.权利要求48所述的工程化的DNA依赖性DNA聚合酶，其中所述DNA依赖性DNA聚合酶融合至序列非特异性DNA结合结构域。50.权利要求49所述的工程化的DNA依赖性DNA聚合酶，其中所述序列非特异性dsDNA结合蛋白来自硫磺矿硫化叶菌的Sso7d。51.权利要求48至50中任一项所述的工程化的DNA依赖性DNA聚合酶，其中[与没有如本文所述工程化的相同的DNA依赖性DNA聚合酶相比]所述DNA依赖性DNA聚合酶表现出增加的持续合成能力、增加的保真度、增加的亲和力、增加的序列特异性、降低的序列特异性和/或增加的协同性。52.权利要求48至51所述的工程化的DNA依赖性DNA聚合酶，其中所述DNA依赖性DNA聚合酶不包含5
’→3’‑
聚合酶活性、3
’→5’
核酸外切酶活性、5
’→3’
核酸外切酶活性和/或5
’→3’
RNA依赖性DNA聚合酶活性中的至少一种。53.第三复合物，其包含能够结合与第一位点和第二位点不同的链上的靶核酸上的第三位点的第三序列特异性DNA结合蛋白和第三DNA核酸内切酶，从而改善错配修复和提高修复效率。54.编码权利要求1至37中任一项所述的第一复合物的多核苷酸。55.编码权利要求38至47中任一项所述的第二复合物的多核苷酸。56.编码权利要求53所述的第三复合物的多核苷酸。57.编码权利要求48至52中任一项所述的工程化的DNA依赖性DNA聚合酶的多核苷酸。58.一种表达盒或载体，其包含一种或多种权利要求54至57中任一项所述的多核苷酸。59.一种RNA分子，包含(a)介导与CRISPR
‑
Cas效应蛋白的相互作用的核酸序列；(b)通过DNA
‑
RNA相互作用将CRISPR
‑
Cas效应蛋白引导至特定核酸靶位点的核酸序列，和(c)形成能够与权利要求48至52的工程化的DNA依赖性DNA聚合酶相互作用的茎环结构的核酸序列。60.一种修饰靶核酸的方法，所述方法包括使所述靶核酸与权利要求4至37中任一项所述的第一复合物接触，从而修饰所述靶核酸。61.权利要求60所述的方法，还包括使所述靶核酸与权利要求38至47中任一项所述的第二复合物接触，从而修饰所述靶核酸。62.权利要求61所述的方法，还包括使所述靶核酸与权利要求53所述的第三复合物接触，从而提高所述靶核酸的修饰的修复效率。
63.一种修饰靶核酸的方法，所述方法包括使所述靶核酸接触：(a)第一序列特异性DNA结合蛋白，其能够结合靶核酸上的第一位点；(b)第一DNA依赖性DNA聚合酶；(c)第一DNA核酸内切酶；和(d)第一DNA编码的修复模板，从而修饰靶核酸。64.权利要求63所述的方法，其中所述第一序列特异性DNA结合蛋白、所述第一DNA依赖性DNA聚合酶、所述第一DNA核酸内切酶和所述第一DNA编码的修复模板形成复合物(其与靶核酸相互作用)。65.权利要求63或权利要求64所述的方法，其中所述第一序列特异性DNA结合蛋白来自多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR
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Cas效应蛋白、蛋白质引导的核酸内切酶(例如，锌指核酸酶)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和/或Argonaute蛋白。66.权利要求63至65中任一项所述的方法，其中所述第一DNA核酸内切酶是核酸内切酶(例如，Fok1)、多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR
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Cas效应蛋白、蛋白质引导的核酸内切酶(例如，锌指核酸酶)和/或转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)。67.权利要求63至66中任一项所述的方法，其中所述第一DNA核酸内切酶是核酸酶或切口酶。68.一种修饰靶核酸的方法，所述方法包括使靶核酸接触：(a)第一序列特异性DNA结合蛋白，其能够结合靶核酸上的第一位点并且包含能够引入单链切口或双链断裂的切口酶活性和/或核酸内切酶活性；(b)第一DNA依赖性DNA聚合酶；和(c)第一DNA编码的修复模板，从而修饰靶核酸。69.权利要求68所述的方法，其中包含核酸内切酶活性的第一序列特异性DNA结合蛋白、第一DNA依赖性DNA聚合酶和第一DNA编码的...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：成对植物服务股份有限公司，
类型：发明
国别省市：