一种重组新城疫病毒rNDV-VEGF-Trap、其基因组、制备方法及其用途技术

本申请公开了一种重组的新城疫病毒基因组、包含该基因组的重组新城疫病毒rNDV

【技术实现步骤摘要】
一种重组新城疫病毒rNDV
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VEGF
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Trap、其基因组、制备方法及其用途


[0001]本申请属于癌症治疗用溶瘤病毒领域，具体而言，涉及一种重组的新城疫病毒基因组、包含该基因组的重组新城疫病毒及其制备方法、编码上述的重组的新城疫病毒基因组的DNA分子以及它们的用途。

技术介绍

[0002]癌症是由于机体细胞失去正常调控、过度增殖而引起的疾病，目前已成为影响健康的第一杀手。我国是癌症尤其是肺癌、胃癌、肝癌及直肠癌高发区。据统计，仅2016年一年全国新增各类癌症患者480万例，230万病人死于各种癌症。随着技术进步，各种新的治疗手段尤其是生物药物治疗不断投入临床使用。但药物的安全性、有效性及病人的生活质量等方面的需求远未得以满足。发展新药或治疗手段势在必行。
[0003]1991年，Martuza等人在《Science》杂志发表文章，证明转基因单纯疱疹病毒在恶性胶质瘤治疗中有一定的效果。至此以后，发展溶瘤病毒治疗癌症就日益受到关注。溶瘤病毒治疗癌症的原理是通过对自然界存在的一些致病力较弱的病毒进行基因改造，让其选择性地感染肿瘤细胞、在细胞内大量复制并最终摧毁肿瘤细胞。同时它还能激发免疫反应，吸引免疫细胞来继续杀死残余癌细胞或通过免疫反应杀灭已迁移的癌细胞。近几十年来，溶瘤病毒相关研究取得了巨大进展。人们先后用新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、1型单纯疱疹病毒(HSV
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1)、呼肠孤病毒(reovirus)、溶瘤腺病毒(oncolytic adenovirus)来开发溶瘤病毒，但临床表现都远低于预期。例如，2005年CFDA批准了溶瘤腺病毒产品H101上市，然而其治疗效果并不理想。
[0004]NDV是一种具有负义单链RNA基因组的禽副粘病毒，它一直是癌症治疗的有希望的方法。但NDV作为单一药物治疗的效果有限，一方面，人体抗病毒免疫反应能够清除病毒，另一方面，人体能够产生中和抗体来抵抗病毒发挥作用。为了提高NDV在癌症中的治疗效率，这些病毒随后用来传递具有抗肿瘤活性的基因，以进一步增强活性。这样的基因包括编码细胞因子或其受体、免疫检查点分子、肿瘤抑制蛋白或免疫刺激蛋白的基因。
[0005]此前，本领域已对在其基因组中整合有编码细胞因子或其受体的基因的重组新城疫病毒进行了众多研究，但仍未取得临床上有益的进展。例如，Pascal Buijs等(Recombinant Immunomodulating Lentogenic or Mesogenic Oncolytic Newcastle Disease Virus for Treatment ofPancreatic Adenocarcinoma，Viruses 2015，7，2980
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2998)研究了表达干扰素或干扰素拮抗蛋白的重组新城疫病毒。
[0006]研究表明血管生成是肿瘤治疗的重要靶标。血管生成是从现有的内皮细胞中生成新的血管，进而向各种器官提供充足氧气和营养的过程，其对于肿瘤的生长和转移至关重要，抗血管生成疗法是癌症治疗的重要方法之一。在肿瘤新生血管形成过程中，支持肿瘤生长的促血管生成因子主要有：血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、血管生成蛋白(angiogenin)和转化生长因子
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β(TGF
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β)等，这些因子
通过与相应的受体结合，激活下游信号通路，从而调控肿瘤新血管的生成。
[0007]大多数抗血管生成药物是靶向作用于促血管生长因子及其受体，或下游信号通路中的关键分子，通过阻断肿瘤的营养供应，从而抑制肿瘤的生长和转移。现有获FDA批准上市的抗血管生成药物主要包括大分子单抗药物和小分子靶向抑制剂。其中，抗血管生成因子主要有血小板应答蛋白
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1(TSP
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1)、血管抑素(angiostain)、内皮抑素(endostain)以及干扰素
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α(IFN
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α)等，以及VEGF阻断/拮抗剂如VEGF
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Trap(通过将VEGFR的Ig结构域与IgG分子的恒定区融合得到)，这些抑制剂可直接抑制血管内皮细胞的增殖与迁移活性，从而抑制血管生成，并阻断肿瘤的生长与转移，能够在癌症治疗中表现出有益的效果。然而，抗血管生成药物的治疗副作用较大。
[0008]针对现有技术中存在的NDV作为单一药物的治疗效果有限、响应率以及肿瘤抑制率较小等限制溶瘤病毒的临床应用的问题，对于可以提高抗肿瘤效果、降低副作用的表达抗肿瘤活性的外源蛋白的重组NDV目前仍需要进行深入的研究。

技术实现思路

[0009]本申请的专利技术人通过将Angiostatin、VEGF
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Trap的编码基因分别整合入新城疫病毒基因组的特定位置，提供一种相应的重组溶瘤病毒，经药效试验验证，发现rNDV
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VEGF
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Trap的抗肿瘤效果显著高于rNDV组和rNDV
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Angiostatin组，其可以在癌细胞中以较强的复制能力进行复制从而杀死宿主癌细胞，同时对非癌细胞具有可靠的安全性，由此解决上述技术问题。
[0010]一方面，本申请提供了一种重组的新城疫病毒基因组，其中，所述基因组包括VEGF
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Trap的编码基因，所述VEGF
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Trap的编码基因位于新城疫病毒基因组的P基因与M基因之间。
[0011]另一方面，本申请提供了一种重组新城疫病毒，其中，所述病毒包含上述的重组的新城疫病毒基因组。
[0012]又一方面，本申请提供了一种编码上述的重组的新城疫病毒基因组的DNA分子。
[0013]又一方面，本申请提供了一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含上述的重组的新城疫病毒基因组、重组新城疫病毒和/或DNA分子。
[0014]又一方面，本申请提供了一种制备上述重组新城疫病毒的方法，其中，所述方法包括：
[0015](1)将含有VEGF
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Trap的编码基因的DNA序列的克隆载体与NDV病毒载体分别进行酶切，并将酶切得到的所述VEGF
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Trap的编码基因的DNA序列与所述NDV病毒载体进行连接，得到重组新城疫病毒质粒；
[0016](2)将所述重组新城疫病毒质粒转染至细胞中并对经转染的细胞进行培养，获得所述重组新城疫病毒。
[0017]又一方面，本申请提供了上述的重组的新城疫病毒基因组、重组新城疫病毒、DNA分子和/或药物组合物在制备用于治疗或改善癌症的药物中的用途。
[0018]通过将VEGF
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Trap的编码基因整合入新城疫病毒基因组的特定位置，能够显著提高所得到的重组溶瘤病毒的抗肿瘤作用和溶瘤效率。
附图说明
[0019]为了更清楚地说明本申请示例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组的新城疫病毒基因组，其中，所述基因组包括VEGF
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Trap的编码基因，所述VEGF
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Trap的编码基因位于新城疫病毒基因组的P基因与M基因之间。2.如权利要求1所述的重组的新城疫病毒基因组，其中，所述VEGF
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Trap的编码基因处于DNA或RNA的形式；优选地，所述VEGF
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Trap的编码基因具有如SEQ ID NO.1所示的序列或与其具有至少80％同一性的序列。3.如权利要求1或2所述的重组的新城疫病毒基因组，其中，所述重组的新城疫病毒基因组的序列以SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.5示出。4.一种重组新城疫病毒，其中，所述病毒包含权利要求1
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3中任一项所述的重组的新城疫病毒基因组。5.如权利要求4所述的重组新城疫病毒，其中，所述新城疫病毒的出发毒株选自：弱毒株LaSota、Hitchner B1、V4，中毒株Mukteswar、Anhinga，强毒株F48E9、JS/7/05/Ch、Italien、Herts/33、NDV
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BJ；以及基于所述出发毒株以基因工程手段构建的任意的嵌合毒株。6.一种编码权利要求1
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3中任一项所述的重组的新城疫病毒基因组的DNA分子。7.一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含权利要求1
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3中任一项所述的重组的新城疫病毒基因组、权利要求4或5所述的重组新城疫病毒和/或权利要求6所述的DNA分子；优选地，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的辅料；优选地，所述药学上可接受的药用辅料选自溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、抗氧剂、渗透促进剂、pH值调节剂、表面活性剂或稀释剂。8.一种制备权利要求4或5所述的重组新城疫病毒的方法，其中，所述方法包括：(1)将含有VEGF
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Trap的编码基因的DNA序列的克隆载体与NDV病毒载体分别进行酶切，并将酶切得到的所述VEGF
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Trap的编码基因的DNA序列与所述NDV病毒载体进行连接，得到重组新城疫病毒质粒；(2)将所述重组新城疫病毒质粒转染至细胞中并对经转染的细胞进行培养，获得所述重组新城疫病毒。9.如权利要求8所述的方法，其中，采用选自如下的载体构建所述克隆载体：PUC57载体、pMD18
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T载体、pMD19
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T载体、pBlueScript SK(+/
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)载...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖伟，李德山，刘天艳，王振中，曹玉凯，刘芝航，
申请(专利权)人：江苏康缘瑞翱生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：