一种球毛壳菌素类化合物的制备方法及应用技术

本发明专利技术属于天然产物化学技术领域，具体涉及一种球毛壳菌素类化合物的制备方法及应用。本发明专利技术提供了一种利用马德里毛壳菌与凝结芽孢杆菌共培养发酵制备球毛壳菌素类化合物的方法，所述方法提取工艺简单，生产成本低，绿色环保，产量高。本发明专利技术还提供了所述球毛壳菌素类化合物的应用，以食管鳞癌KYSE

【技术实现步骤摘要】
一种球毛壳菌素类化合物的制备方法及应用


本专利技术属于天然产物化学
，具体涉及一种球毛壳菌素类化合物的制备方法及应用。

技术介绍

马德里毛壳菌(Chaetomium madrasense)属于子囊菌门、毛壳属真菌。该属真菌能产生结构多样且生物活性显著的次生代谢产物，如：细胞松弛素类、氧杂蒽酮类、蒽醌类、色酮类、缩酚酸环醚类、萜类和甾体类化合物等，这些化合物大多具有抗肿瘤、抗疟疾或细胞毒性、酶抑制活性和抗菌活性等。凝结芽孢杆菌(B.coagulans)由于其含有乳酸菌和芽孢杆菌的双重特性，所以既能像乳酸菌和双歧杆菌一样具有益生作用，又具有芽孢菌的抗逆性强、耐高温高压和易贮藏等优点，凝结芽孢杆菌能够改善肠道菌群结构、调节肠道功能紊乱、维持肠道内菌群平衡，还能提高机体免疫水平、促进营养物质代谢和利用。微生物在自然界是以混合菌落的形式存在的，与单一菌株相比，混合菌落能够完成更为复杂的任务，那些承袭了百年甚至千年的天然传统发酵工艺均是采用混合菌落实现的天然混合培养，例如食品发酵和酿酒。其中就包括共培养技术，时至今日，共培养技术的发展已经同传统的天然混合培养有了本质的区别，它着重强调的是人们有目的、有意识地利用高通量技术和生物信息平台挖掘新的活性物质并提高产量，例如，Ola等通过三线镰孢(Fusarium tricinctum)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)共培养，发现3个新结构化合物Macrocarpon C、N
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(carboxymethyl)
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anthranilic acid和Citreoisocoumarinol，并且能够实现具有抗菌活性的恩镰孢菌素A1(Enniatin A1)的产量提高78倍(Ola ARB,Thomy D,Lai DW,et al.Inducing secondary metabolite production by the endophytic fungus Fusarium tricinctum through coculture with Bacillus subtilis[J].Journal of Natural Products,2013,76(11):2094
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2099)。微生物产生的次级代谢产物种类多样，是天然药物的重要来源，尤其是特殊生境的微生物为适应特殊生态环境，往往具有特异的遗传特性和代谢特性，能够产生具有生物活性的新颖结构化合物和特效药物先导化合物。细胞松弛素是一类具有显著生物学功能的真菌多聚氨基酸杂合次级代谢产物，同时也是一种具有高度取代的异吲哚酮衍生物。其典型的结构特点是具有一个三环骨架结构，其中一个大环骈和在异吲哚酮骨架上。研究发现，该类化合物具有广泛的抗肿瘤、抗菌、抗病毒等生物活性。球毛壳菌素类生物碱是一类具有大环结构的吲哚类生物碱，属于细胞松弛素类化合物，目前已发现的结构类似物约有100种，具有广泛的应用前景。细胞焦亡是依赖于Gasdermin(GSDM)家族蛋白的一种调控性细胞死亡，在肿瘤、感染、神经系统和动脉粥样硬化等疾病的发生发展中发挥重要作用。研究已证实，化疗药物可通过BAK/BAX
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caspase
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GSDME信号通路引起肿瘤细胞焦亡的发生，并可经caspase
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3蛋白进行细胞凋亡和细胞焦亡间的转换。
专利技术人前期研究发现球毛壳菌素类生物碱可抑制多种肿瘤细胞增殖，尤其是对食管鳞癌细胞，是一种具有应用潜力的化疗药物。

技术实现思路

本专利技术提供了一种利用马德里毛壳菌与凝结芽孢杆菌共培养发酵制备球毛壳菌素类化合物的方法，所述方法提取工艺简单，生产成本低，绿色环保，产量高。本专利技术还提供了所述球毛壳菌素类化合物的应用，以食管鳞癌KYSE
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30细胞为研究对象，采用MTT，western blot、高表达或敲低等实验方法研究了分离得到球毛壳菌素类化合物(球毛壳菌素类生物碱)的抗食管鳞癌活性，并探讨其作用机制，以期对细胞焦亡诱导药物的开发提供一定的技术支持。为达到上述目的，本专利技术创造的技术方案是这样实现的：一种球毛壳菌素类化合物，结构式如下：一种利用马德里毛壳菌与凝结芽孢杆菌共培养发酵制备球毛壳菌素类化合物的方法，包括以下步骤：(1)菌种活化、制备种子液：将凝结芽孢杆菌接种到LB固体培养基上，于35
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37℃的温度下培养3～5d，获得凝结芽孢杆菌活化菌种；将马德里毛壳菌接种到平板培养基上，于25
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30℃的温度下培养5～7d，获得马德里毛壳菌活化菌种；将凝结芽孢杆菌活化菌种接种到LB液体培养基中，于35
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37℃的温度下培养5～7d，得到种子液；(2)共同培养：将步骤(1)制备的种子液接种到大米培养基中，在24～28℃温度下培养5～7d，然后接入马德里毛壳菌活化菌种进行共同培养，继续发酵培养30
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35d，得固体发酵物；(3)粗提物制备：将步骤(2)的固体发酵物经乙酸乙酯浸提，浓缩，干燥，回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯粗提物；(4)硅胶柱层析：将步骤(3)制备的粗提物，经两次硅胶柱层析，并经薄层层析检测，合并相同流份，得到十个流分，按照流分极性由小到大，依次编号为Fr1
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10；(5)化合物纯化：将步骤(4)制备的流份经重结晶、葡聚糖凝胶柱层析或硅胶柱层析进行纯化，得到所述球毛壳菌素类化合物。
具体的，所述LB固体培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂20.0g/L，pH 7.4
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0.1；所述平板培养基的配方为：蛋白胨10.0g/L、酵母浸出粉10.0g/L、葡萄糖40.0g/L、琼脂20.0g/L，pH 6.0
±
0.1。具体的，步骤(2)中种子液接种到大米培养基中的接种量(体积分数)为0.5
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0.8％。具体的，步骤(2)中大米培养基为，将60g大米、100mL水放置于500mL三角瓶中，然后在121℃温度、0.12MPa压力下灭菌制得。具体的，所述步骤(3)中乙酸乙酯浸提的过程为：将步骤(2)的固体发酵物与乙酸乙酯按体积比1：1.5混合，再用玻璃棒搅拌，分散均匀，常温下浸提3次，每次浸提10
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12h。具体的，所述步骤(4)中两次硅胶柱层析具体步骤为：将粗提物与80
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100目硅胶拌样，装柱，以200～300目减压硅胶柱为固定相，依次用流动相I、流动相II进行梯度洗脱，再取部分洗脱液，浓缩，干燥，以200～300目硅胶柱为固定相，依次用流动相I、流动相II进行二次梯度洗脱；所述流动相I是体积比为100:1、50:1、20:1、10:1的石油醚和乙酸乙酯；所述流动相II是体积比为100:1、50:1、20:1、10:1的二氯甲烷和甲醇。具体的，所述步骤(5)中重结晶具体步骤为：将步骤(4)得到的流份浓缩、过滤后，依次用二氯甲烷和甲醇洗涤，滤渣用二氯甲烷和甲醇混合液(其中二氯甲烷和甲醇体积比为1：1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种球毛壳菌素类化合物，其特征在于，结构式如下：2.一种利用马德里毛壳菌与凝结芽孢杆菌共培养发酵制备球毛壳菌素类化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)菌种活化、制备种子液：将凝结芽孢杆菌接种到LB固体培养基上，于35
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37℃的温度下培养3～5d，获得凝结芽孢杆菌活化菌种；将马德里毛壳菌接种到平板培养基上，于25
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30℃的温度下培养5～7d，获得马德里毛壳菌活化菌种；将凝结芽孢杆菌活化菌种接种到LB液体培养基中，于35
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37℃的温度下培养5～7d，得到种子液；(2)共同培养：将步骤(1)制备的种子液接种到大米培养基中，在24～28℃温度下培养5～7d，然后接入马德里毛壳菌活化菌种进行共同培养，继续发酵培养30
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35d，得固体发酵物；(3)粗提物制备：将步骤(2)的固体发酵物经乙酸乙酯浸提，浓缩，干燥，回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯粗提物；(4)硅胶柱层析：将步骤(3)制备的粗提物，经两次硅胶柱层析，并经薄层层析检测，合并相同流份，得到十个流分，按照流分极性由小到大，依次编号为Fr1
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10；(5)化合物纯化：将步骤(4)制备的流份经重结晶、葡聚糖凝胶柱层析或硅胶柱层析进行纯化，得到所述球毛壳菌素类化合物。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中种子液接种到大米培养基中的接种量为0.5
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0.8％。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中两次硅胶柱层析具体步骤为：将粗提物与80
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100目硅胶拌样，装柱，以200～300目减压硅胶柱为固定相，依次用流动相I、流动相II进行梯度洗脱，再取部分洗脱液，浓缩，干燥，以200～300目硅胶柱为固定相，依次用流动相I、流动相II进行二次梯度洗脱；所述流动相I是体积比为100:1、50:1、20:1、10:1的石油醚和乙酸乙酯；所述流动相II是体积比为100:1、50:1、20:1、10:1的二氯甲烷和甲醇。5.球毛...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭庆丰，陈林，石磊，王鑫杨，李丹丹，尹震花，张娟娟，康文艺，
申请(专利权)人：黄河科技学院，
类型：发明
国别省市：