半夏流式细胞术分析过程中消除酚酸类物质影响及防止细胞核粘连的样品制备方法技术

本发明专利技术提供了一种半夏流式细胞术分析过程中消除酚酸类物质影响及防止细胞核粘连的样品制备方法，本发明专利技术是配置针对半夏流式细胞术分析的细胞裂解液，该细胞裂解液包括MOPS、Sodium citrate、PVP

【技术实现步骤摘要】
半夏流式细胞术分析过程中消除酚酸类物质影响及防止细胞核粘连的样品制备方法


[0001]本专利技术涉及植物流式细胞术检测分析
，具体涉及一种半夏流式细胞术分析过程中消除酚酸类物质影响及防止细胞核粘连的样品制备方法。

技术介绍

[0002]半夏(Pinellia ternata)为天南星科多年生草本植物。“半夏”一词早见于《礼记
·
月令》中：“蒲月半夏生，盖当夏之半，故为名也”。半夏的干燥块茎是一味常用、大宗药材，为历代医家所推崇，不仅供中医临床配方使用，也是多种中成药的原料。半夏性温、味辛、有毒，传统医学上主要用于燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结等，主要含有琥珀酸等小分子酚酸类、生物碱、多糖及半夏蛋白等活性成分，现代药学研究表明，半夏还具有抗肿瘤、抗生育和抗心律失常等药理作用，因而引起国内外学者的普遍重视。
[0003]我国半夏资源丰富，遍布于贵州、四川、山东、湖北、河南、安徽等地，半夏叶型和叶数的变化，很难划清变种间界限，药用植物分类学家将全部半夏居群均命名为Pinellia。不同地区的半夏群体之间具有丰富的倍性变异，因倍性的不同导致半夏植株表型、产量、抗性和药用成分含量差异较为明显。这严重影响半夏药材质量的稳定性，给半夏的规范化生产带来多重困难。因此，对于半夏倍性的研究，在半夏品种鉴定、种群进化，以及杂交组合的选配、杂交后代材料的提前筛选等方面具有重要意义。
[0004]流式细胞术(flow cytometry,FCM)是利用流式细胞仪对处于线性流动的细胞中的生物大分子进行快速检测收集分类的综合技术，相较于传统形态观察法、染色体计数法，流式细胞术具有样品制备方便、分析快速、相对准确、数据采集量大等优点，因此其被广泛应用在大规模植物倍性分析及基因组大小估测上。
[0005]流式细胞术对植物进行检测分析的关键是制备杂质和细胞随便较少的完整流式细胞术样品，即植物细胞核悬浮液。流式细胞术样品制备中最关键的步骤有二，一是选择合适的细胞裂解液，降低次生代谢物的影响；二是将使用适当的组织破碎方法将细胞核分离出来。由于不同植物的次生代谢物组成和含量不同，使用流式细胞术鉴定倍性和基因组大小时，样品制备方法、所需的细胞裂解液也各不相同。
[0006]半夏作为药用植物，其与常规作物相比，半夏含有更为丰富的酚类次生代谢物，如：如芹菜苷、7
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甲基芹菜定、黄芩素、黄芩苷、6
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醛基异麦冬黄酮B、6C
‑
β
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D吡喃二糖
‑
8C
‑
β
‑
D
‑
吡喃半乳糖
‑
5,7,4
’‑
三羟基黄酮等黄酮类成分；E
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对
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香豆醇、松柏苷、Sachaliside 1、3，4
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二羟基肉桂醇等苯丙素类成分；尿黑酸、原儿茶醛、姜烯酚、姜酚等含有酸性酚羟基的苯酚类物质。这些酚类次生代谢物极易氧化，干扰染色，且容易出现絮凝现象，导致用常规细胞裂解液处理时不能得到理想的效果，在流式细胞术分析进样时容易出现黏连、杂峰的状况。另外，目前，在对植物组织进行破碎时，通常采用的方法是使用刀片将组织快速切碎，切碎的时间和程度难以标准化，导致样品进行流式细胞术测定时误差大。
[0007]因此，需要针对半夏特殊化学组成改进细胞裂解液，改善样品制备方法，以使最终
制备得到的样品适用于流式细胞仪的分析。

技术实现思路

[0008]综上所述，为了克服现有技术问题的不足，本专利技术提供了一种半夏流式细胞术分析过程中消除酚酸类物质影响及防止细胞核粘连的样品制备方法，它是配置针对半夏流式细胞术分析的细胞裂解液，能够有效的移走半夏细胞中的细胞质，分散半夏样品中的叶绿体，维持细胞核的完整性，消除半夏中酚酸类物质对DNA染色的影响，减少细胞核粘连，减少半夏流式细胞术分析时的杂峰。
[0009]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种半夏流式细胞术分析过程中消除酚酸类物质影响及防止细胞核粘连的样品制备方法，其中：包括以下工艺步骤：S1：配置细胞裂解液细胞裂解液包括以下组分15~25mmol/L MOPS、25~35mmol/L Sodium citrate、0.5~1.5%（W/V）PVP
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40、0.1~0.3%（V/V）TritonX
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100、5~10 mmol/L DTT、 40~60mmol/L MgCl2及蒸馏水，按量称取各组分后加入容器中，然后向容器内少量多次加入蒸馏水，并搅拌至完全溶解，之后向容器内加入蒸馏水定容至1L，调节容器内溶液pH至7.0， 至此完成细胞裂解缓释液的制备，制备的细胞裂解缓释液放置在4℃温度环境下冷藏保存备用，S2：配置PI染色缓冲液PI染色缓冲液包括组分RNase A水溶液及碘化丙啶水溶液，体积比为1:1.2~1.6，所述的RNase A水溶液的浓度为1 mg/ml，碘化丙啶水溶液的浓度为1 mg/ml，按体积比量取RNase A水溶液及碘化丙啶水溶液并混匀后，在4℃温度环境下避光保存备用；S3：叶片采样在半夏出苗后6~10天，选取颜色为嫩绿色、大小为1.5~2.5cm2、且稍微卷曲未完全展开的幼嫩叶片为待采样叶片，采样时，避开主叶脉，割取1.5~2 cm2叶片作为叶片样品，用蒸馏水冲洗叶片样品2~3遍，再用去离子水冲洗2~3遍，然后用滤纸吸干叶片样品表面水分后备用；S4：制备样品将步骤S3中采样取得的半夏叶片样品放于试管中，向试管内加入氧化锆珠，再加入预冷的步骤S1制备的细胞裂解液，然后将试管置于细胞破碎仪中进行组织破碎，组织破碎后的试管在4 ℃温度环境下静置，然后将试管内的溶液倒入带滤网的流式管中，之后再向流式管内加入预冷的步骤S2中制备的PI染色缓冲液，并轻轻晃动混匀，之后在4 ℃温度环境下下避光孵育30
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60 min，制得符合流式细胞仪上机检测标准的半夏单细胞核悬浮液。
[0010]本专利技术的技术方案还可以是这样实现的：所述的步骤S1中，所述的细胞裂解液包括以下组分20mmol/L MOPS、30mmol/L Sodium citrate、1%（W/V）PVP
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40、0.2%（V/V）TritonX
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100、8 mmol/L DTT、 50mmol/L MgCl2及蒸馏水，按量称取各组分后加入容器中，然后向容器内少量多次加入蒸馏水，并搅拌至完全溶解，之后向容器内加入蒸馏水定容至1L，调节容器内溶液pH至7.0，最后4 ℃温度环境下冷藏保存。
[0011]本专利技术的技术方案还可以是这样实现的：所述的步骤S2中RNase A水溶液与碘化丙啶水溶液的体积比为1:1.4。
[0012]本专利技术的技术方案还可以是这样实现的，所述的步骤S3中，采样的半夏苗为大棚生长或室内生长的半夏苗时，采样取得的叶片样品直接进行样品制备；采样的半夏苗为大田幼苗或野外幼苗时，采样取得的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种半夏流式细胞术分析过程中消除酚酸类物质影响及防止细胞核粘连的样品制备方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：S1：配置细胞裂解液细胞裂解液包括以下组分15~25mmol/L MOPS、25~35mmol/L Sodium citrate、0.5~1.5%（W/V）PVP
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40、0.1~0.3%（V/V）TritonX
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100、5~10 mmol/L DTT、 40~60mmol/L MgCl2及蒸馏水，按量称取各组分后加入容器中，然后向容器内少量多次加入蒸馏水，并搅拌至完全溶解，之后向容器内加入蒸馏水定容至1L，调节容器内溶液pH至7.0，至此完成细胞裂解缓释液的制备，制备的细胞裂解缓释液放置在4℃温度环境下冷藏保存备用；S2：配置含有RNase A的PI染色缓冲液PI染色缓冲液包括组分RNase A水溶液及碘化丙啶水溶液，体积比为1:1.2~1.6，所述的RNase A水溶液的浓度为1 mg/ml，碘化丙啶水溶液的浓度为1 mg/ml，按体积比量取RNase A水溶液及碘化丙啶水溶液并混匀后，在4℃温度环境下避光保存备用；S3：叶片采样在半夏出苗后6~10天，选取颜色为嫩绿色、大小为1.5~2.5cm2、且稍微卷曲未完全展开的幼嫩叶片为待采样叶片，采样时，避开主叶脉，割取1.5~2 cm2叶片作为叶片样品，用蒸馏水冲洗叶片样品2~3遍，再用去离子水冲洗2~3遍，然后用滤纸吸干叶片样品表面水分后备用；S4：制备样品将步骤S3中采样取得的半夏叶片样品放于试管中，向试管内加入氧化锆珠，再加入预冷的步骤S1制备的细胞裂解液，然后将试管置于细胞破碎仪中进行组织破碎，组织破碎后的试管在4 ℃温度环境下静置，然后将试管内的溶液倒入带滤网的流式管中，之后再向流式管内加入预冷的步骤S2中制备的PI染色缓冲液，并轻轻晃动混匀，之后在4 ℃温度环境下下避光孵育30
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60 min，制得符合流式细胞仪上机检测标准的半夏单细胞核悬浮液。2.根据权利要求1所述的半夏流式细胞术分析过程中消除酚酸类物质影响及防止细胞核粘连的样品制备方法，其特征在于：所述的步骤S1中，所述的细胞裂解液包括以下组分20mmol/L MOPS、30mmol/L Sodium citrate、1%（W/V）PV...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛晓瑾，杨铁钢，史贵霞，理向阳，郭晓阳，
申请(专利权)人：河南省农业科学院经济作物研究所，
类型：发明
国别省市：