一株对奶牛乳房炎致病菌有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及粪污处理领域，具体涉及一株对奶牛乳房炎致病菌有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用。本发明专利技术提供的解淀粉芽孢杆菌已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为：CGMCC NO.24846。本发明专利技术所述解淀粉芽孢杆菌对奶牛源无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有拮抗作用，且具有较好的纤维素、蛋白质、淀粉分解能力，所述的解淀粉芽孢杆菌可作为抑制菌及菌剂应用于牛粪再生垫料的生产和使用过程中。生产和使用过程中。

【技术实现步骤摘要】
一株对奶牛乳房炎致病菌有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用


[0001]本专利技术涉及粪污处理领域，具体涉及一株对奶牛乳房炎致病菌有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用。

技术介绍

[0002]牛粪再生垫料是以牛粪为原料，通过好氧发酵等技术手段生产的一种牛床垫料，已经成为牛粪资源化利用的一种重要技术手段。相较传统垫料，牛粪再生垫料具有原料获取便利且廉价的先天优势，但与沙子等无机垫料相比，牛粪本身就携带许多致病菌，且作为有机物更容易造成微生物的繁殖，因此杀菌是生产牛粪再生垫料过程中必不可少的步骤。
[0003]然而，在实际生产过程中，奶牛乳房炎致病菌并不能被彻底杀灭，且在牛粪再生垫料使用过程中，奶牛场为了节约成本，垫料不能做到每天更换，这个过程中通过牛体、空气流动等进入垫料的致病微生物会逐渐随着积累和繁殖而增多，包括链球菌(Streptococcus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)等奶牛乳房炎致病菌。奶牛乳房炎会导致牛奶产量下降、品质降低、奶牛死亡和淘汰，被认为是奶制品行业成本最高的疾病之一。因此，一种适用于牛粪再生垫料生产和使用过程中抑制奶牛乳房炎致病菌的微生物菌剂是目前市场需要的。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一株对奶牛乳房炎致病菌有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用。
[0005]第一方面，本专利技术提供一株解淀粉芽孢杆菌，保藏编号为CGMCCNO.24846，可在牛粪环境中快速增殖。
>[0006]本专利技术从牛粪沼渣中筛选出对奶牛源无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌抑菌圈最大的菌株，进行16s rRNA测序，并建立系统发育树，由16s rRNA测序结果及系统发育树结果和形态学分析，确定抑菌圈最大的菌株为解淀粉芽孢杆菌，命名为解淀粉芽孢杆菌DN
‑
1。
[0007]本专利技术所提供的解淀粉芽孢杆菌DN
‑
1已在2022年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名：解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，保藏编号为CGMCC NO.24846。
[0008]第二方面，本专利技术提供一种菌剂，含上述的解淀粉芽孢杆菌。
[0009]第三方面，本专利技术提供一种发酵方法，以上述的解淀粉芽孢杆菌作为发酵菌，以纤维素、蛋白质或淀粉作为碳源进行发酵。
[0010]第四方面，本专利技术提供一种解淀粉芽孢杆菌发酵液或发酵上清液，所述解淀粉芽孢杆菌发酵液由上述发酵方法发酵得到；所述解淀粉芽孢杆菌发酵上清液，由解淀粉芽孢
1.0g，MgSO4·
7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，琼脂14.0g，去离子水1000mL，pH值自然，加热融化后，121℃灭菌20min，待冷却至50℃倒平板。
[0029]0.9％NaCl溶液：NaCl 9.0g，去离子水1000mL，121℃灭菌20 min。
[0030]LB肉汤培养基配方为：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl10.0g，1000mL去离子水，溶解后121℃灭菌20min。
[0031]LB琼脂培养基配方为：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0 g，琼脂15.0g，1000mL去离子水，溶解后121℃灭菌15min，待其冷却至50℃到平板。
[0032]筛选步骤，具体如下：
[0033](1)取50g牛粪沼渣置于锥形瓶中，封口膜封口后放入恒温箱 37℃富集5d。
[0034](2)取5g富集后的牛粪沼渣置于锥形瓶中，加入45g的0.9％ NaCl溶液，充分震荡，取1mL上清液用0.9％NaCl溶液稀释成10
‑2～ 10
‑5浓度梯度，取100μL不同浓度梯度的稀释液涂布于CMC
‑
Na培养基。在生化培养箱中倒置培养24h后，选取不同形态的单一菌落进行数次划线分离，直至纯化成单一菌株。
[0035](3)将待测菌株接种在LB平板上培养24h进行活化，然后用接种环挑取待测菌株接种于LB液体培养基，置于恒温震荡培养箱37℃、 150r/min培养至对数生长期，进行抑菌试验。
[0036](4)将待测菌株接种在LB平板上培养24h进行活化，然后用接种环挑取待测菌株接种于LB液体培养基，置于恒温震荡培养箱37℃、150r/min培养24h，将发酵液在4℃，4000r/min离心12min，将离心后的上清液用22m的水系滤膜过滤2次，进行抑菌试验。
[0037](5)取100μL稀释至107cfu/mL的致病菌菌液涂布在LB平板上，待菌液晾干后用直径6mm的打孔器在平板上打4个孔，其中1个孔内注入30μL的LB液体培养基作为对照组，其余3个孔内注入30μL步骤 (3)的待测菌液或步骤(4)的过滤后的上清液，在超净工作台内放置至菌液扩散完毕，将平板置于37℃条件下培养24h，测量待测菌株中，抑菌效果最好的菌株的抑菌圈，见表1。
[0038]表1抑菌效果最好的菌株的抑菌圈
[0039] 无乳链球菌/mm金黄色葡萄球菌/mm大肠杆菌/mm菌液抑菌圈直径13.16
±
0.0911.69
±
0.048.22
±
0.04上清液抑菌圈直径14.14
±
0.99
‑‑
[0040]选择抑菌圈最大的菌株进行16s rRNA测序，并建立系统发育树，系统发育树见图1。由16s rRNA测序结果及系统发育树结果和形态学分析，确定抑菌圈最大的菌株为解淀粉芽孢杆菌，命名为解淀粉芽孢杆菌DN
‑
1。解淀粉芽孢杆菌DN
‑
1的菌落形态及显微镜镜检形态，见图2和图3。
[0041]实施例2解淀粉芽孢杆菌DN
‑
1具有多种物质分解能力
[0042]本实施例提供解淀粉芽孢杆菌DN
‑
1的多种物质分解能力测试，测试所用培养基及步骤如下。
[0043]蛋白质培养基的配方为：牛肉膏3g，酪蛋白10g，NaCl 5g， K2HPO
4 2g，溴百里香酚蓝0.05g，琼脂粉15g，去离子水1000mL， pH值为7.3～7.5，121℃灭菌20min，待冷却至50℃倒平板。
[0044]刚果红染色液：刚果红1g，去离子水1000mL。
[0045]脱色液：NaCl 58.5g，去离子水1000mL。
[0046]淀粉培养基的配方为：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉3.0g，NaCl 5.0 g，可溶性淀粉30.0g，琼脂15.0g，pH 7.8。
[0047]测试方法的步骤如下：
[0048]将实施例1筛选出的解淀粉芽孢杆菌DN
‑
1接种于LB平板上， 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，保藏编号为CGMCC NO.24846，可在牛粪环境中快速增殖。2.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌。3.一种发酵方法，其特征在于，以权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌作为发酵菌，以纤维素、蛋白质或淀粉作为碳源进行发酵。4.一种解淀粉芽孢杆菌发酵液或发酵上清液，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌发酵液由权利要求3所述发酵方法发酵得到；所述解淀粉芽孢杆菌发酵上清液，由解淀粉芽孢杆菌发酵液经离心、过滤后得到。5.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌或权利要求2所述菌剂或权利要求3所述发酵方法或权利要求4所述解淀粉芽孢杆菌发酵液或发酵上清液在抑制奶牛乳房炎致病菌中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述奶牛乳房炎致病菌包括奶牛源无乳链球菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：段娜，屈安安，郭钰，徐永洞，周嘉良，郑鑫，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：