一种适用于新型生物样本口腔液的新型冠状病毒IgG抗体检测方法及其应用技术

本发明专利技术为一种适用于新型生物样本口腔液的新型冠状病毒IgG抗体检测方法及其应用，本发明专利技术公开了口腔液样本采集、处理方法以及采样质控方法，提供了能够检测口腔液的新型冠状病毒IgG抗体的磁微粒化学发光方法，确立了口腔液检测新型冠状病毒IgG抗体的临界值。本发明专利技术首次公开了利用磁微粒化学发光法检测口腔液样本新型冠状病毒IgG抗体的检测方法，并用大量实验数据证明检测方法具有很高的灵敏度、特异度；口腔液采集无创、安全、便捷、高效，降低医护人员感染风险。护人员感染风险。护人员感染风险。

【技术实现步骤摘要】
一种适用于新型生物样本口腔液的新型冠状病毒IgG抗体检测方法及其应用


[0001]本申请属于病毒检测领域，尤其涉及一种新型冠状病毒的检测方法及其应用，更具体地涉及一种适用于新型生物样本口腔液的新型冠状病毒IgG抗体检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒与中东呼吸综合征冠状病毒MERS
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CoV，严重急性呼吸综合征冠状病毒SARS
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CoV同属于冠状病毒科，冠状病毒为有包膜的单股正链RNA病毒，其基因组长大约为26000
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32000bp，是目前已知的最大的RNA病毒。
[0003]新型冠状病毒肺炎疑似病例IgM、IgG检测的血清学诊断，以及大规模新冠病毒疫苗接种后SARS
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CoV
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2特异性抗体检测，都需要采集血液样本进行检测，而采血具有一定的创伤性和潜在感染风险，受采者依从性差，并需要专业医护人员操作和专业的采血场所。
[0004]人体口腔液(Oral fluids)，是唾液和口腔粘膜渗出液的混合液体，是机体抵御病原微生物感染的第一道防线。唾液主要由口腔内下颌下腺、腮腺、舌下腺三对大唾液腺分泌。口腔粘膜渗出液是指牙龈结缔组织中富含的毛细血管渗出液，因此IgG、IgA、IgM等成分与血液成分相近，因此，混合的口腔液样本比唾液样本更适用于检测新型冠状病毒抗体。
[0005]新冠疫情早期，国外有使用唾液进行新冠病毒抗体检测，检测方法主要是酶联免疫吸附方法(ELISA)。其缺点是唾液含有的抗体量很少，检测灵敏度低；ELISA检测方法灵敏度、特异度较低，并且操作繁琐、耗时长，自动化程度不高。并且唾液标本采集无法进行质量控制。
[0006]国内有联合检测唾液中新型冠状病毒抗原和抗体的技术专利，检测方法是胶体金方法，胶体金技术缺点是灵敏度低，不能定量检测，不能区分IgG、IgM抗体类型。
[0007]现阶段，中国药监批准的新型冠状病毒抗体检测试剂常用方法包括ELISA、胶体金和荧光免疫层析法、化学发光法，但这些方法都是基于血清样本的检测方法。没有针对口腔液的新型冠状病毒抗体检测试剂[1]。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供一种适用于新型生物样本口腔液的新型冠状病毒IgG抗体灵敏、高通量检测方法。
[0009]本专利技术提供一种用无创、安全、便捷的口腔液检测新型冠状病毒抗体，克服采血的创伤性，降低医护人员感染风险，也弥补了唾液检测灵敏度差的不足。
[0010]进一步的，本专利技术提供一种检测口腔液新型冠状病毒IgG抗体的化学发光法，化学发光法具备高灵敏度、高特异性，快速、准确、可自动化、适合大批量样本检测等特点，克服胶体金灵敏度低、无法自动化的缺点；克服ELISA方法的灵敏度、特异度低、操作复杂、耗时长的缺点。并建立口腔液采集和检测的质量控制方法，克服了唾液采集无法质控的缺点。
[0011]优选的，本专利技术所述的方法包括如下步骤：
[0012]口腔液标本采集：使用口腔液采样刷，在齿龈部位，上下左右反复刷90秒，直至刷头完全浸湿，将采样刷放回采样管中，盖上管帽，保存，24h内送至实验室进行标本处理。标本处理液的配制：包括以下成分:胎牛血清、PH＝7.4的PBS缓冲液、庆大霉素、青链霉素。优选的，可以在其中另外添加红色染料。以100mL标本处理液为例，具体配置如下：10％胎牛血清、1％庆大霉素、1％青链霉素及0.5％红色染料，余量为PBS；具体是10mL胎牛血清、1mL庆大霉素(50mg/mL)、1mL青链霉素(青霉素10000U/mL,链霉素10000ug/mL)、88％PBS(PH＝7.2)。
[0013]口腔液标本的处理：加0.5
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1mL标本处理液于采样管中，手持采样刷柄部反复多次在管内壁挤压海绵刷头，直至挤干，将海绵刷头倒插入采样管管帽中，盖上管帽，1500rpm离心1min，收集采样管中液体至2ml无菌管中，立即检测；若不能立即检测，则
‑
20℃保存。
[0014]口腔液样本采集质量控制：选取口腔液成分人总IgG抗体(Total IgG)作为质控指标，在检测新型冠状病毒IgG抗体的同时，检测样本中的Total IgG，通过检测大量人群口腔液样本，计算人群口腔液Total IgG参考值范围，确定口腔液合格标本的判定标准：当口腔液的Total IgG浓度大于等于临界值0.356
‑
0.497μg/mL为合格标本，小于临界值为采样不合格，予以剔除，减少检测假阴性结果。
[0015]磁微粒化学发光法建立：选择新型冠状病毒棘突蛋白(spike protein，S)受体结合区(RBD区)为抗原，用异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗原，用抗FITC抗体标记磁珠，通过抗FITC抗体与FITC结合使抗原抗体复合物结合在磁珠上，在外加磁场中沉淀，去上清后清洗沉淀的复合物，加入碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgG单克隆抗体，形成“磁性颗粒
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S蛋白RBD抗原
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新型冠状病毒RBD IgG抗体
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碱性磷酸酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体”复合物，加入底物液，碱性磷酸酶催化底物液发光，形成发光反应。采用化学发光法免疫分析仪，测定各标本的发光值。标本发光值与其中新型冠状病毒抗体浓度呈正相关，从而检测人口腔液标本中的新型冠状病毒IgG抗体。
[0016]临界值(Cut
‑
off值)的确立：选择197例未接种新冠肺炎疫苗的空白健康人群(血清新冠病毒IgG抗体均阴性)，161例接种新冠肺炎疫苗第三针受试者(血清IgG抗体均为阳性)，检测其口腔液的新冠病毒IgG抗体，使用SPSS21软件进行ROC曲线绘制。经过计算确定cut
‑
off值为86397.5
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94530时。
[0017]阳性对照的制备：取5份口腔液检测结果阳性的样本混合，经56℃灭活30分钟后，加处理液稀释至工作浓度，分装后储存于
‑
20℃。
[0018]阴性对照的制备：用样本处理液1：100稀释胎牛血清，分装后储存于
‑
20℃。
[0019]具体的检测步骤：(1)加样：将50
‑
80μL口腔液样和40
‑
60μL FITC标记新型冠状病毒重组抗原加入于反应管中；若样本中含有新型冠状病毒RBD
‑
IgG抗体，则与FITC标记新型冠状病毒重组抗原形成复合物RBD
‑
IgG抗体
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S蛋白RBD抗原；(2)加磁珠并孵育：加入30
‑
50μL磁性微粒
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抗异硫氰酸荧光素(FITC)抗体(同上)，37℃孵育15
‑
20分钟，形成RBD
‑
IgG抗体
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S蛋白RBD抗原
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磁性颗粒复合物；清洗液洗3次，洗去游离的成本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适用于新型生物样本口腔液的新型冠状病毒IgG抗体检测的口腔液标本处理液，其特征在于所述口腔液标本处理液包括以下成分:胎牛血清、PH＝7.4的PBS缓冲液、庆大霉素、青链霉素。2.如权利要求1所述的口腔液标本处理液，其特征在于各个部分的浓度为：10％胎牛血清、1％庆大霉素、1％青链霉素，余量为PBS，优选的，其中还可以添加0.5％的红色染料。3.一种利用权利要求1所述的口腔液标本处理液进行口腔液标本处理的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
⑴
口腔液采集：使用口腔液采样刷，在齿龈部位，上下左右反复刷90秒，放回采样管中，保存，24h内送至实验室进行标本处理；
⑵
口腔液处理：利用0.5
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1mL研发配制的标本处理液，对采样刷进行震荡、混匀、挤压、洗脱、离心，最后将口腔液收集到2ml无菌管中，立即检测；若不能立即检测，则
‑
20℃保存。4.一种用于新型冠状病毒IgG抗体检测的新型生物样本口腔液采集的质量控制方法，其特征在于包括如下步骤，(1)采用权利要求3的方法进行样本处理；(2)选取口腔液成分人总IgG(Total IgG)抗体作为质控指标，通过检测大量人群口腔液样本，计算人群口腔液人总IgG参考值范围，确定口腔液合格标本的判定标准：当口腔液的人总IgG浓度大于等于临界值0.356
‑
0.497μg/mL为合格标本，小于临界值为采样不合格，予以剔除，减少检测假阴性结果。5.一种含有权利要求1所述口腔液标本处理液的新型冠状病毒抗体检测试剂盒。6.一种如权利要求1所述的口腔液标本处理液或权利要求5所述的新型冠状病毒抗体检测试剂盒在制备新型冠状病毒抗体检测药物中的用途。7.如权利要求6所述的用途，其特征在于所述检测药物的检测基于磁微粒化学发光检测，所述检测包括如下步骤：(1)选择新型冠状病毒棘突蛋白(spike protein，S)RBD区具有中和活性的重组蛋白作为抗原，用异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗原；(2)用抗FITC抗体标记磁珠，通过抗FITC抗体与FITC结合使抗原抗体复合物结合在磁珠上，在外加磁场中沉淀免疫复...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄芳，许文波，董梅，毛乃颖，黄琪，王怡婷，谢会，于霞丽，李爱华，王雪，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，
类型：发明
国别省市：