扩增或者检测含有全长poly(A)的全长转录组cDNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种扩增或者检测含有全长poly(A)的全长转录组cDNA的方法。所述方法包括：(1)单细胞反应制备；(2)末端延伸：以带Poly(dT)的10

【技术实现步骤摘要】
扩增或者检测含有全长poly(A)的全长转录组cDNA的方法


[0001]本专利技术属于生物检测领域，具体涉及扩增或者检测含有全长poly(A)的全长转录组cDNA的方法及其应用。

技术介绍

[0002]全长转录组测序作为生命科学研究的基础，促进了各物种基因功能、基因表达调控以及进化关系等多方面的基础与应用研究。目前全长转录组的研究实际上是只包含部分poly(A)的读取，无法反映poly(A)长度的真实信息，而RNA poly(A)尾巴是成熟的mRNA和lncRNA的重要组成部分，对RNA稳定性和翻译也有重要的调控作用，现poly(A)尾检测的相关技术仍然非常有限，二代测序无法对同聚物长序列进行读取。近期，文献报道了一种新的基于PacBio平台的poly(A)长度的检测方法PAIso
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seq，可在获得全长转录组信息的同时得到poly(A)长度信息。
[0003]目前基于PacBio Iso
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Seq开发了一套可检测的poly(A)尾检测技术PAIso
‑
seq，实现了对RNA poly(A)尾序列的测定。建库过程：首先通过含U的oligo dT进行末端延伸，延伸完后将含U的oligo dT进行消化，保留RT引物进行模板置换，获得全长cDNA并进行扩增再进行环状接头连接构建了保留RNA poly(A)尾的PAIso
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seq文库，进行测序。(详细建库流程见：https://www.nature.com/articles/s41467/>‑
019
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13228
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9#Sec11的fig.1。文献出处：Liu,Y.,Nie,H.,Liu,H.et al.Poly(A)inclusive RNA isoform sequencing(PAIso
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seq)reveals wide
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spread non
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adenosine residues within RNA poly(A)tails.Nat Commun 10,5292(2019).https://doi.org/10.1038/s41467
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019
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9。)
[0004]现有技术主要面向群体细胞水平，而在单细胞水平目前受限于方法的检测通量，无法实现高通量单细胞含全长poly(A)的转录组检测，单细胞全长转录本(含全长poly(A))导致检测时间长，成本高。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是为克服现有技术中不能高通量地检测或者扩增包含全长poly(A)长度的转录组，只能挑单个细胞进行反应的缺陷，提供一种扩增或者检测含有全长poly(A)的全长转录组cDNA的方法。本专利技术的所述方法可以实现单细胞层面的包含全长poly(A)长度的全长转录组检测。且基于10X Genomics和PacBio平台的高通量单细胞的全长poly(A)转录组产品，提供了更精细化演化细胞发育或改变的过程的完整方案。
[0006]一方面，尽管目前高通量技术发展相对较为成熟，然而尚没有高通量是针对可以检测polyA的技术。且目前的检测带上polyT，也只是为了捕捉到mRNA，通过随机的结合在polyA的任意位置来检测到mRNA的信息。但本专利技术人特异性地利用10X Genomics平台中gel beads上的关键性结构，调整了原10X的试剂盒内的master mix使其不局限于cDNA合成，并结合TSO技术检测，能够实现高通量单细胞的全长poly(A)转录组的检测，提供了更精细化演化细胞发育或改变的过程的完整方案。
[0007]另一方面，目前的高通量(同时标记上千个单细胞以便区分)的单细胞测序需要依托于微流控技术将单个细胞分离，且高通量的单细胞测序只能检测3端序列；而能检测polyA全长的技术无法做到高通量，因此本技术在不变更现有元件的情况下可以做含polyA全长的转录组检测，有其不可替代的作用。
[0008]本专利技术通过以下技术方案解决上述技术问题。
[0009]本专利技术的技术方案之一为：一种基于10X genomics单细胞平台扩增或者检测含有全长poly(A)的全长转录组cDNA的方法，所述方法包括：
[0010](1)单细胞反应制备；其包括a)制备单细胞悬液；b)配制Master mix；c)将a)和b)混匀，得混匀液并制备液滴；其中所述Master mix包括dNTP、无5
’‑
>3
’
外切酶活性的DNA聚合酶和缓冲液；
[0011](2)末端延伸：以带Poly(dT)的10
×
barcoded gel beads为模板，使带poly(A)的转录本末端延伸得单链的产物1；
[0012](3)模板置换：对所述产物1进行反转录，在反转录产物后的3
’
末端添加3个碱基C；并添加TSO引物进行反应得产物2；
[0013](4)PCR扩增：对所述产物2进行PCR扩增。
[0014]所述步骤(1)中用到的缓冲液可为常规的逆转录缓冲液。例如为可包含50mM Tris
‑
HCl、pH 8.3，75mM KCl，3mM MgCl2以及0.02M DTT的缓冲液；也可以为NEB缓冲液2，例如包含50mM NaCl，10mM Tris
‑
HCl，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液。
[0015]在本专利技术一较佳实施方案中，以上步骤(1)的“a)制备单细胞悬浮液”中，每43.2μL所述单细胞悬浮液通过将8μL RNase抑制剂以及浓度为700～1200cells/μL的标准品细胞混合，并补足NF水制得；所述标准品细胞的个数优选10000个。
[0016]在本专利技术一较佳实施方案中，以上步骤(1)的“b)配制Master mix”中，每31.8μL所述Master mix包含6.1μL浓度为10μM的dNTP、9.7μL浓度为50units/μL的Klenow片段、14μL 10
×
NEB缓冲液2以及2μL还原剂B；所述缓冲液为10
×
NEB缓冲液2。
[0017]在本专利技术一较佳实施方案中，以上步骤(1)的“c)所述制备液滴”为：将所述混匀液、Gel Beads和Partitioning Oil分别依次加入到GEM Chip G的row labeled 1、2和3中，在GEM Chip G上覆盖上10
×
Gasket并制备液滴。
[0018]优选地，在所述液滴中，所述单细胞悬浮液、Master mix、Gel Beads和Partitioning Oil的体积比为43.2:31.8:50:45。
[0019]较佳地，步骤(2)所述的末端延伸包括：
[0020]a)将步本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于10X genomics单细胞平台扩增或者检测含有全长poly(A)的全长转录组cDNA的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)单细胞反应制备；其包括a)制备单细胞悬液；b)配制Master mix；c)将a)和b)混匀，得混匀液并制备液滴；其中所述Master mix包括dNTP、无5
’‑
>3
’
外切酶活性的DNA聚合酶和缓冲液，所述缓冲液例如包括50mM NaCl、10mM Tris
‑
HCl、10mM MgCl2和1mM DTT；(2)末端延伸：以带Poly(dT)的10
×
barcoded gel beads为模板，使带poly(A)的转录本末端延伸得单链的产物1；(3)模板置换：对所述产物1进行反转录，在反转录产物后的3
’
末端添加3个碱基C；并添加TSO引物进行反应得产物2；(4)PCR扩增：对所述产物2进行PCR扩增。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的单细胞反应制备包括：a)制备单细胞悬浮液，每43.2μL所述单细胞悬浮液通过将8μL RNase抑制剂以及浓度为700～1200cells/μL的标准品细胞混合，并补足NF水制得；所述标准品细胞的个数优选10000个；和/或，b)配制Master mix，其中每31.8μL所述Master mix包含6.1μL浓度为10μM的dNTP、9.7μL浓度为50units/μL的Klenow片段、14μL 10
×
NEB缓冲液2以及2μL还原剂B；所述缓冲液为10
×
NEB缓冲液2；和/或，c)所述制备液滴为：将所述混匀液、Gel Beads和Partitioning Oil依次加入到GEM Chip G的row labeled 1、2和3中，在GEM Chip G上覆盖上10
×
Gasket并制备液滴；优选地，在所述液滴中，所述单细胞悬浮液、Master mix、Gel Beads和Partitioning Oil的体积比为43.2:31.8:50:45。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的末端延伸包括：a)将步骤(1)中所得产物于37℃反应1小时；b)向步骤a)所得产物按4:5体积比加入Recovery Agent，待液体分层后去除Recovery Agent与Partitioning Oil的混合液体；其中a)中所得产物使用例如100μL，b)中所述Recovery Agent使用例如125μL。4.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(3)之前对步骤(2)所得产物进行样品纯化和引物消化；所述样品纯化包括：1)将Dynabeads MyOne SILANE、Cleanup Buffer、Reducing Agent B与Nuclease
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free Water混匀，配制Dynabeads Cleanup Mix；其中，所述Dynabeads MyOne SILANE、所述Cleanup Buffer、所述Reducing Agent B以及Nuclease
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free Water的体积比例如为8:182:5:5，所述Dynabeads Cleanup Mix的体积例如为200μL；2)将所述Dynabeads Cleanup Mix与步骤(2)所得产物混匀、室温静置；可选地，再吹打混匀一次室温静置；所述静置的时间例如为5分钟；3)按Dynabeads Cleanup...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐冲，谢哲，陈智超，郭梅，瓮喆，
申请(专利权)人：深圳华大基因科技服务有限公司，
类型：发明
国别省市：