一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方法，1、包括以下步骤：步骤一：选择一组健康对照者、一组卵巢囊腺瘤患者和一组上皮性卵巢癌患者。本研究中关于卵巢癌血清细胞外囊泡的蛋白组学研究，提出了血清细胞外囊泡中的蛋白质分子FGA,FGB,FGG,FGL1,APOL1,APOA4,ITIH3,MUC16可作为卵巢癌诊断的分子标志物，并通过PRM进行了验证，此外，研究中基于血清细胞外囊泡蛋白组学结果建立的卵巢癌诊断模型在全部以及早期的卵巢癌病人中都表现出较好的诊断效能，可对临床上现有的卵巢癌诊断措施进行补充，提供一个新的卵巢癌诊断思路和策略，能够帮助实现卵巢癌的早期诊断，从而改善患者生存和预后。从而改善患者生存和预后。从而改善患者生存和预后。

【技术实现步骤摘要】
一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方法


[0001]本专利技术涉及医疗
，特别涉及一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方法。

技术介绍

[0002]目前，盆腹腔检查、影像学检查以及血清肿瘤标志物血清糖类抗原125是临床上最常用的卵巢癌诊断方法，但是这些诊断措施中，盆腹腔检查和影像学检查高度依赖于医师的专业水平和检查人员的经验技能，此外，早期或非典型表现的患者由于缺乏典型的症状和体征，肿瘤部位隐匿等原因极易被漏诊，CA125是临床广泛使用的卵巢癌血清肿瘤标志物，用于卵巢癌的诊断和预后监测等，然而，CA125对早期卵巢癌的敏感性差，且在其他非肿瘤的情况下也有升高，作为卵巢癌的诊断指标其特异性不能令人满意，因此，找到新的敏感度和特异度高的卵巢癌肿瘤标志物是非常有必要的。

技术实现思路

[0003]本申请的目的在于提供一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方法，以解决上述
技术介绍
中提出的CA125是临床广泛使用的卵巢癌血清肿瘤标志物，用于卵巢癌的诊断和预后监测等，然而，CA125对早期卵巢癌的敏感性差，且在其他非肿瘤的情况下也有升高，作为卵巢癌的诊断指标其特异性不能令人满意的问题。
[0004]为实现上述目的，本申请提供如下技术方案：一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方法，包括以下步骤：
[0005]步骤一：选择一组健康对照者、一组卵巢囊腺瘤患者和一组上皮性卵巢癌患者；
[0006]步骤二：对患者和健康对照者提取血清样品，从患者血清中分离提取细胞外囊泡后利用TEM、NTA、WB和生物信息学分析对其进行鉴定；
[0007]步骤三：通过LC
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MS/MS分析，鉴定出所有的可定量蛋白质，并筛选出组间的差异表达蛋白，并通过PRM验证，ROC分析得出可作为卵巢癌诊断标志物的蛋白标记物；
[0008]步骤四：进行单因素和多因素logistic回归分析，对蛋白标记物建立诊断模型，回归方程为LogitP＝2.481*FGG+8.970*MUC16
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1.709*APOA4
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0.184，并判断是否具有诊断效能。
[0009]优选的，所述卵巢肿瘤患者为进行过卵巢肿瘤手术且有术后病理结果的患者，所述卵巢肿瘤患者在血液采集前未接受其他治疗，所述卵巢肿瘤患者没有其他器官或部位肿瘤病变，所述卵巢肿瘤患者没有其他血液疾病、感染性疾病、内分泌疾病、免疫或代谢性疾病。
[0010]优选的，所述血清样品均于患者入院后在空腹状态下采集，首先采集血液样本于BDvacutainer血清管中，室温下，血液静置凝固1到2小时，然后4℃冰箱过夜使血块固缩，血清析出，随后将析出的血清4℃，3000g离心10分钟，离心后的上清转移至新的Eppendorf离心管中，分装保存于
‑
80℃冰箱。
[0011]优选的，所述细胞外囊泡提取时，血清样品从－80℃冰箱取出，冰上融化，在4℃，12000g离心10
‑
15分钟，离心后将上清液转移至新的离心管，0.22μM微孔滤膜过滤后用细胞外囊泡提取试剂盒qEVoriginalSizeExclusionColumn去分离提取细胞外囊泡，具体步骤如下，首先将分离柱放置在支架上，使其垂直，盖好底部的luer
‑
slipcap，然后取下盖子，打破真空密封，取下luer
‑
slipcap，用至少10mlPBS洗脱缓冲液冲洗柱子，盖上luer
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slipcap，用移液器移去顶部的缓冲液，用移液器向分离柱中加入500μl血清样品，取下luer
‑
slipcap，开始收集分离过滤后的样本，最开始的3ml是空隙体积，继续向分离柱中添加PBS以洗脱囊泡，最后收集空隙体积后的0.5ml液体为高纯度细胞外囊泡。
[0012]优选的，所述NTA分析中，细胞外囊泡用PBS重悬，使用NanosightNS300对重悬液体中纳米颗粒的布朗运动进行实时动态跟踪，观察并获得相应的粒径分布及浓度信息，所述TEM分析中，使用透射电子显微镜，首先用PBS重悬试剂盒提取的细胞外囊泡，吸取5
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10μl重悬的待观察细胞外囊泡样本滴加于电镜的专用的铜网上，室温下放置进行沉淀1
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2分钟，并用滤纸吸去浮液，先用PBS进行漂洗，然后吸取磷钨酸(PTA)5
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10μl滴加于铜网上，沉淀并进行负染色1
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2分钟，用滤纸吸去浮液，常温下干燥2分钟，上机成像，电镜下观察并记录细胞外囊泡的形态特征。
[0013]优选的，所述WB分析中，首先提取细胞外囊泡蛋白质，细胞外囊泡提取后放置于－80℃冰箱保存，使用时从冰箱取出，冰上溶解，避免反复冻融，向细胞外囊泡溶液中加入已配制好的RIPA蛋白裂解液，冰上裂解10
‑
15分钟，使细胞外囊泡蛋白质裂解；
[0014]然后测定蛋白浓度，配制BCA的工作液：按照50:1的比例将BCA蛋白浓度检测试剂盒中的A液和B液混合后配制成BCA工作液，室温放置备用，按照每个反应孔200μl工作液准备，取一个96孔板，根据实验需求设置好标准蛋白孔和待测样品孔，将BCA工作液加入到96孔板中，每孔200μl，BCA蛋白浓度测定试剂盒提供的标准的蛋白液浓度为2mg/ml，用ddH2O稀释试剂盒中的标准蛋白液，配制成梯度蛋白，浓度分别为2000μg/ml，1000μg/ml，500μg/ml，250μg/ml，125μg/ml，0μg/ml，待测蛋白样品用ddH2O稀释10倍，向每孔中加入20μl的梯度蛋白液和稀释后的待测蛋白样品，混匀，37℃避光孵育30分钟，测定562nm波长下的吸光度，用标准蛋白品的浓度和吸光度OD562值绘制标准曲线，计算浓度公式，根据公式计算出待测蛋白样品的浓度；
[0015]蛋白变性，将测好浓度的蛋白用ddH2O进行稀释，根据WB每孔50μg/20μl的上样量，计算所要加入的ddH2O和4
×
蛋白上样缓冲液，进而配制WB的上样体系，然后将配制好的WB上样体系混匀后放入100℃金属浴，加热变性10分钟，取出后立即将蛋白样品置于冰上或者于
‑
20℃冰箱冻存备用；
[0016]SDS
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PAGE凝胶电泳，选择玻璃板，流水冲洗，洗涤剂洗刷，洗净玻璃板表面的污渍和颗粒物，室温晾干或烤箱烘干，将玻璃板安装在制胶架上，注意使玻璃板底部平齐并密切接触制胶架上的胶条避免发生渗漏，根据待测蛋白样品的分子量大小选择合适的浓度，常用浓度分离胶具体配制方式见表2
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6，中等分子量选择10％SDS
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PAGE，小分子量选择12％SDS
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PAGE，大分子量选择8％SDS
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PAGE，分离胶配制完成后，混匀，加入玻璃板中至距离顶端2cm处，检查有无渗漏，若无渗漏加入异丙醇压平，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：选择一组健康对照者、一组卵巢囊腺瘤患者和一组上皮性卵巢癌患者；步骤二：对患者和健康对照者提取血清样品，从患者血清中分离提取细胞外囊泡后利用TEM、NTA、WB和生物信息学分析对其进行鉴定；步骤三：通过LC
‑
MS/MS分析，鉴定出所有的可定量蛋白质，并筛选出组间的差异表达蛋白，并通过PRM验证，ROC分析得出可作为卵巢癌诊断标志物的蛋白标记物；步骤四：进行单因素和多因素logistic回归分析，对蛋白标记物建立诊断模型，回归方程为LogitP＝2.481*FGG+8.970*MUC16
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1.709*APOA4
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0.184，并判断是否具有诊断效能。2.根据权利要求1所述的一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方法，其特征在于：所述卵巢肿瘤患者为进行过卵巢肿瘤手术且有术后病理结果的患者，所述卵巢肿瘤患者在血液采集前未接受其他治疗，所述卵巢肿瘤患者没有其他器官或部位肿瘤病变，所述卵巢肿瘤患者没有其他血液疾病、感染性疾病、内分泌疾病、免疫或代谢性疾病。3.根据权利要求2所述的一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方法，其特征在于：所述血清样品均于患者入院后在空腹状态下采集，首先采集血液样本于BDvacutainer血清管中，室温下，血液静置凝固1到2小时，然后4℃冰箱过夜使血块固缩，血清析出，随后将析出的血清4℃，3000g离心10分钟，离心后的上清转移至新的Eppendorf离心管中，分装保存于
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80℃冰箱。4.根据权利要求1所述的一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方法，其特征在于：所述细胞外囊泡提取时，血清样品从－80℃冰箱取出，冰上融化，在4℃，12000g离心10
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15分钟，离心后将上清液转移至新的离心管，0.22μM微孔滤膜过滤后用细胞外囊泡提取试剂盒qEVoriginalSizeExclusionColumn去分离提取细胞外囊泡，具体步骤如下，首先将分离柱放置在支架上，使其垂直，盖好底部的luer
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slipcap，然后取下盖子，打破真空密封，取下luer
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slipcap，用至少10mlPBS洗脱缓冲液冲洗柱子，盖上luer
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slipcap，用移液器移去顶部的缓冲液，用移液器向分离柱中加入500μl血清样品，取下luer
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slipcap，开始收集分离过滤后的样本，最开始的3ml是空隙体积，继续向分离柱中添加PBS以洗脱囊泡，最后收集空隙体积后的0.5ml液体为高纯度细胞外囊泡。5.根据权利要求4所述的一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方法，其特征在于：所述NTA分析中，细胞外囊泡用PBS重悬，使用NanosightNS300对重悬液体中纳米颗粒的布朗运动进行实时动态跟踪，观察并获得相应的粒径分布及浓度信息，所述TEM分析中，使用透射电子显微镜，首先用PBS重悬试剂盒提取的细胞外囊泡，吸取5
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10μl重悬的待观察细胞外囊泡样本滴加于电镜的专用的铜网上，室温下放置进行沉淀1～2分钟，并用滤纸吸去浮液，先用PBS进行漂洗，然后吸取磷钨酸5
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10μl滴加于铜网上，沉淀并进行负染色1
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2分钟，用滤纸吸去浮液，常温下干燥2分钟，上机成像，电镜下观察并记录细胞外囊泡的形态特征。6.根据权利要求4所述的一种血清细胞外囊泡中上皮性卵巢癌肿瘤标志物的检测方法，其特征在于：所述WB分析中，首先提取细胞外囊泡蛋白质，细胞外囊泡提取后放置于－80℃冰箱保存，使用时从冰箱取出，冰上溶解，避免反复冻融，向细胞外囊泡溶液中加入已配制好的RIPA蛋白裂解液，冰上裂解10
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15分钟，使细胞外囊泡蛋白质裂解；
然后测定蛋白浓度，配制BCA的工作液：按照50:1的比例将BCA蛋白浓度检测试剂盒中的A液和B液混合后配制成BCA工作液，室温放置备用，按照每个反应孔200μl工作液准备，取一个96孔板，根据实验需求设置好标准蛋白孔和待测样品孔，将BCA工作液加入到96孔板中，每孔200μl，BCA蛋白浓度测定试剂盒提供的标准的蛋白液浓度为2mg/ml，用ddH2O稀释试剂盒中的标准蛋白液，配制成梯度蛋白，浓度分别为2000μg/ml，1000μg/ml，500μg/ml，250μg/ml，125μg/ml，0μg/ml，待测蛋白样品用ddH2O稀释10倍，向每孔中加入20μl的梯度蛋白液和稀释后的待测蛋白样品，混匀，37℃避光孵育30分钟，测定562nm波长下的吸光度，用标准蛋白品的浓度和吸光度OD562值绘制标准曲线，计算浓度公式，根据公式计算出待测蛋白样品的浓度；蛋白变性，将测好浓度的蛋白用ddH2O进行稀释，根据WB每孔50μg/20μl的上样量，计算所要加入的ddH2O和4
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蛋白上样缓冲液，进而配制WB的上样体系，然后将配制好的WB上样体系混匀后放入100℃金属浴，加热变性10分钟，取出后立即将蛋白样品置于冰上或者于
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20℃冰箱冻存备用；SDS
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PAGE凝胶电泳，选择玻璃板，流水...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨国奋，赖慧玲，何伟鹏，郭云云，孙婷婷，李媛媛，田黎明，吴琳祥，张祖威，
申请(专利权)人：中山大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：