一种细胞外囊泡保存方法技术

本发明专利技术公开了一种细胞外囊泡保存方法。通过向含细胞外囊泡的PBS缓冲液中依次加入2

【技术实现步骤摘要】
一种细胞外囊泡保存方法


[0001]本专利技术涉及细胞外囊泡储存技术，具体涉及一种细胞外囊泡保存方法。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡是由细胞释放的具有双层膜结构的囊泡的总称，按直径大小可分为凋亡小体(1
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5μm)、微囊泡(0.1
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1μm)和外泌体(40
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150nm)，其中，在细胞发生凋亡后提取的微囊泡(0.1
‑
1μm)又称作凋亡微囊泡。
[0003]细胞外囊泡的内容物包括蛋白质、RNAs等多种生物大分子，且可通过膜受体
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受体相互作用、膜融合、内吞、胞饮等方式将内容物传递至其他细胞，因此是细胞间交流沟通的重要方式。近年来的大量研究表明，细胞外囊泡在维持内环境稳态、免疫调节、组织修复和再生、疾病治疗中具有广泛的应用价值。
[0004]但是，细胞外囊泡在体外极不稳定，即使冻存于
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80度，也难以长时间保证其形态的完整和功能的维持，且不便于运输，这极大地限制了细胞外囊泡的临床应用。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的缺陷或不足，本专利技术提供了2
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甲基咪唑和乙酸锌联合在细胞外囊泡室温干燥保存中应用。
[0006]进一步，本专利技术提供了一种细胞外囊泡保存方法。为此，本专利技术所提供内的保存方法包括：向含有细胞外囊泡的缓冲液中加入2
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甲基咪唑和乙酸锌混匀后室温静置，得到可室温保存的细胞外囊泡。
[0007]进一步，室温静置后收集沉淀物，对沉淀物室温干燥保存。
[0008]进一步，向含有细胞外囊泡的缓冲液中加入含2
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甲基咪唑缓冲液和含乙酸锌的缓冲液混匀后室温静置后室温干燥保存。
[0009]进一步，向保存后的沉淀物中加入含EDTA的缓冲液，混匀后收集沉淀为被保存细胞外囊泡。
[0010]本专利技术还提供了经上述方法处理后的细胞外囊泡。
[0011]经本专利技术方法处理后的细胞外囊泡稳定性极大提高，可脱离缓冲液，体外长期干燥保存(至少为7天)。进一步，需要纯净的细胞外囊泡时，只需用解离液去除ZIF
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8，即可获得形态完整的细胞外囊泡。
附图说明
[0012]图1A为实施例1所得的凋亡微囊泡正常形态的扫描电镜(SEM)图，图1B为实施例1中ZIF
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8包封凋亡微囊泡后的SEM图；
[0013]图2为实施例1空ZIF
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8和ZIF
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8包封的凋亡微囊泡(凋亡微囊泡@ZIF
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8)的X射线衍射(XRD)图；
[0014]图3为实施例1ZIF
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8包封凋亡微囊泡前后核酸荧光染色图，A为单纯凋亡微囊泡
组，B为ZIF
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8包封后的凋亡微囊泡组；
[0015]图4为实施例1单纯凋亡微囊泡室温干燥保存12h和ZIF
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8包封的凋亡微囊泡室温干燥保存12h并解离ZIF
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8后的TEM图，A为单纯凋亡微囊泡，B为被ZIF
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8包封并于12h后解离ZIF
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8的凋亡微囊泡；
[0016]图5为实施例1单纯凋亡微囊泡室温干燥保存7天和ZIF
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8包封的凋亡微囊泡室温干燥7天并解离ZIF
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8的SEM图，A为单纯凋亡微囊泡，B为被ZIF
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8包封并于7天后解离ZIF
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8的凋亡微囊泡；
[0017]图6为对比例处理后的囊泡的SEM图；
[0018]图7为实施例2ZIF
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8包封凋亡小体后的SEM图；
[0019]图8为实施例2单纯凋亡小体室温干燥保存12h与ZIF
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8包封的凋亡小体室温干燥保存12h并解离ZIF
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8后的SEM图，A为单纯凋亡小体，B为被ZIF
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8包封并于12h后解离ZIF
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8的凋亡小体；
[0020]图9为实施例2单纯凋亡小体室温干燥保存72h与ZIF
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8包封的凋亡小体室温干燥72h并解离ZIF
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8的SEM图，A为单纯凋亡小体，B为被ZIF
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8包封并于72h后解离ZIF
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8的凋亡小体；
[0021]图10为实施例3各组骨髓间充质干细胞成骨诱导1周后的ALP染色结果图及定量分析结果，其中，A为空白对照组的ALP染色结果图；B为凋亡微囊泡新鲜提取组的ALP染色结果图；C为凋亡微囊泡保存1周组的ALP染色结果图；D为定量分析结果。
具体实施方式
[0022]除非有特殊说明，本文中的技术与科学术语根据相关领域普通技术人员的认识理解。还应理解，本文涉及的温度、浓度是近似值，用于说明目的。虽然与本文描述的方法和材料相似或等价的方法和材料可以用于本公开的实施，但下文描述了部分适合的方法和材料。本文提到的出版物、专利申请、专利和其他参考文献以引用方式部分纳入本文，如出现冲突，以本文为准。另外，所述材料、方法、溶液浓度和实施例仅是示例性的，而并不意欲进行限制。具体方案中，本领技术人员可以根据本专利技术所公开内容采用常规实验时段对方法中所涉及的物质配比、浓度、操作参数取值进行优化以实现本专利技术的目的。
[0023]本文所述的干燥是相对于缓冲液环境、溶剂环境、非生理环境来讲的，具体是指在采用本专利技术的方法处理后离心获得沉淀物后直接保存，或进一步将沉淀物经水洗、甲醇离心洗涤后直接保存。
[0024]本专利技术在含细胞外囊泡的缓冲液中依次加入2
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甲基咪唑和乙酸锌，形成ZIF
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8稳定包封的细胞外囊泡，可在室温环境下长期稳定储存，也可将ZIF
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8包封的细胞外囊泡离心收集后室温保存，保存过程中抵抗干燥等非生理环境。下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明，但本专利技术的保护范围并不限于所述内容。
[0025]实施例1：
[0026]该实施例对提取的RAW264.7巨噬细胞系来源的凋亡微囊泡用本专利技术的方法进行室温保存，具体方案如下：
[0027]提取凋亡微囊泡：使用含10％无外泌体血清的高糖DMEM培养基培养RAW264.7小鼠巨噬细胞系(该细胞购自ATCC)，用500nM星孢菌素(购自：Cell Signaling Technology)刺
激细胞12h后，收集细胞培养上清；800g离心15min，取上清至新的离心管；2000g离心10min，取上清至新的离心管；16000g离心30min，弃上清，沉淀即为凋亡微囊泡，其扫描电镜图如图1A所示；
[0028]之后用PBS缓冲液离心洗涤掉残留培养基后，再用1ml PBS缓冲液重悬凋亡微囊泡以维持其生物活性；向重悬后的含囊泡PBS缓冲液中分别加入2
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.2
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甲基咪唑和乙酸锌联合在细胞外囊泡室温干燥保存中应用。2.一种细胞外囊泡保存方法，其特征在于，方法包括：向含有细胞外囊泡的缓冲液中加入2
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甲基咪唑和乙酸锌混匀后室温静置，得到可室温保存的细胞外囊泡。3.如权利要求2所述的细胞外囊泡保存方法，其特征在于，室温静置后收集沉淀物，对沉淀物室温干燥保存。4.如权利要求2所述的细胞外囊泡保存方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：何奕德，冀吉昀，宋文，李哲，张玉梅，王勤涛，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：