一种饲料中真菌毒素的提取方法和检测方法技术

本发明专利技术提供了一种真菌毒素的提取方法和检测方法，涉及分析检测技术领域。本发明专利技术以乙腈作为提取溶剂，对饲料中交链孢酚、交链孢烯、玉米赤霉烯酮、交链孢毒素II和腾毒素的提取率高；采用超声提取能够实现多个样品的高通量处理，处理效率高，检测效率高；通过C18吸附剂和PSA吸附剂进行净化，能够很好的除去饲料中的大部分色素、脂类及其它杂质，通过正己烷净化能够进一步去除脂类等弱极性杂质，对真菌毒素净化效果好，检测灵敏度、准确性和稳定性高，实现了5种真菌毒素的定性和定量检测，为饲料检验提供技术支撑，弥补了目前针对交链孢酚、交链孢烯、交链孢毒素II和腾毒素4种物质检测方法的空白，值得推广应用。值得推广应用。值得推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种饲料中真菌毒素的提取方法和检测方法


[0001]本专利技术涉及分析检测
，具体涉及一种饲料中真菌毒素的提取方法和检测方法。

技术介绍

[0002]链格孢属真菌属于丝状真菌，是一种普遍存在于水果、蔬菜、田间作物以及存储的饲料等中的病原体和腐生菌，由于它们可以在低温、潮湿的环境下生长繁殖，因此是导致冷藏或长途运输过程中水果、蔬菜、谷物、饲料等腐烂变质的重要病原菌之一，产生的毒素不仅严重危害人类健康和畜禽生产安全，也造成了经济损失。
[0003]链格孢霉毒素主要包括交链孢酚(Alternariol，AOH)、交链孢烯(Altenuene，ALT)、交链孢毒素II(Altertoxins II，ATX II)和腾毒素(Tentoxin，TEN)等。目前，我国已制定饲料中黄曲霉毒素B1，赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T
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2毒素和伏马毒素的限量标准，但缺乏链格孢霉毒素的限量标准。链格孢霉毒素现用的检测方法有薄层色谱分析、液相色谱法、气相色谱、气相色谱与质谱联用仪，超高效液相色谱
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串联质谱法和竞争酶联免疫吸附法等，但是这些方法适用基质不包含饲料，而且检测种类较少。因此，有必要建立饲料中链格孢霉毒素的快速、灵敏分析新技术。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种饲料中真菌毒素的提取方法和检测方法，采用本专利技术提供的方法能够快速、准确的实现饲料中交链孢酚、交链孢烯、玉米赤霉烯酮、交链孢毒素II和腾毒素的定性与定量检测。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种饲料中真菌毒素的提取方法，包括以下步骤：
[0007]将待测饲料与乙腈混合进行超声提取，将得到提取物溶解于甲醇中，得到甲醇复溶液；
[0008]将所述甲醇复溶液依次进行吸附净化和正己烷洗涤，得到真菌毒素提取液；所述吸附净化用吸附剂包括C18吸附剂和PSA吸附剂；
[0009]所述真菌毒素包括交链孢酚、交链孢烯、玉米赤霉烯酮、交链孢毒素II和腾毒素中的一种或几种。
[0010]优选的，所述待测饲料的质量与乙腈的体积之比为1g：5～10mL。
[0011]优选的，所述待测饲料包括渔用饲料。
[0012]优选的，所述超声提取的功率≥600W，温度为40～45℃，时间≥30min。
[0013]优选的，所述待测饲料的质量与甲醇的体积之比为1g：0.5～1mL。
[0014]优选的，所述待测饲料和吸附剂的质量比为1：0.2～0.6。
[0015]优选的，所述C18吸附剂的粒径为40～50μm。
[0016]优选的，所述PSA吸附剂为乙二胺
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丙基硅烷化硅胶；所述PSA吸附剂的粒径为40
～60μm。
[0017]本专利技术提供了一种饲料中真菌毒素的检测方法，包括以下步骤：
[0018]对上述技术方案所述提取方法得到的真菌毒素提取液中的真菌毒素进行液相色谱串联质谱检测。
[0019]优选的，所述液相色谱的检测条件包括：色谱柱为C18柱；柱箱温度为40℃；进样量为5μL；流动相体系为流动相A和流动相B，所述流动相A为甲醇，所述流动相B为水；所述流动相体系的流速为0.3mL/min；洗脱方式为梯度洗脱；
[0020]所述梯度洗脱的程序为：
[0021]0.00～2.00min：所述流动相A的体积百分含量为90％；
[0022]2.00～4.00min：所述流动相A的体积百分含量由10％匀速增加到95％；
[0023]4.00～8.00min：所述流动相A的体积百分含量为95％；
[0024]8.00～8.10min：所述流动相A的体积百分含量由95％匀速减少到10％；
[0025]8.10～10.00min：所述流动相A的体积百分含量为10％；
[0026]所述质谱的检测条件包括：离子源为电喷雾离子源；检测方式为多反应监测；扫描方式为负离子模式；喷雾电压为3.0kV；离子传输管温度为320℃；脱溶剂气温度为300℃。
[0027]本专利技术提供了一种真菌毒素的提取方法，包括以下步骤：将待测饲料与乙腈混合进行超声提取，将得到提取物溶解于甲醇中，得到甲醇复溶液；将所述甲醇复溶液依次进行吸附净化和正己烷洗涤，得到真菌毒素提取液；所述吸附净化用吸附剂包括C18吸附剂和PSA吸附剂；所述真菌毒素包括交链孢酚、交链孢烯、玉米赤霉烯酮、交链孢毒素II和腾毒素中的一种或几种。本专利技术提供的检测方法，采用乙腈作为提取溶剂，对饲料中交链孢酚、交链孢烯、玉米赤霉烯酮、交链孢毒素II和腾毒素的提取率高，进而提高检测的灵敏度、准确性和稳定性；而且，与振荡提取和均质提取相比，本专利技术采用超声提取能够实现多个样品的高通量处理，处理效率高，检测效率高。通过C18吸附剂和PSA吸附剂进行净化，能够很好的除去饲料中的大部分色素、脂类、蛋白质、有机酸等杂质，通过正己烷净化能够进一步去除脂类等弱极性杂质，对5种真菌毒素净化效果好，进一步提高了后续液相色谱串联质谱法对5种真菌毒素检测的灵敏度、准确性和稳定性。
[0028]本专利技术还提供了一种饲料中真菌毒素的检测方法，包括以下步骤：对上述技术方案所述提取方法得到的真菌毒素提取液进行液相色谱串联质谱检测。采用本专利技术提供的提取方法得到的真菌毒素提取液杂质少，液相色谱串联质谱法对5种真菌毒素检测的灵敏度、准确性和稳定性，采用液相色谱串联质谱法实现了5种真菌毒素的定性和定量检测，为饲料检验提供技术支撑，弥补了目前针对交链孢酚、交链孢烯、交链孢毒素II和腾毒素4种物质检测方法的空白。
[0029]如实施例测试结果所示，本专利技术提供的检测方法的平均加标回收率75.1％～87.3％(准确度，n＝6，满足60％～120％要求)，相对标准偏差(变异系数，RSD)3.33％～9.05％。说明，本专利技术提供方法的提取和净化效果好，灵敏度高、准确性和稳定性好，适合于饲料样品中真菌毒素的多残留、高通量检测。
附图说明
[0030]图1为加标样品溶液MRM谱图；
[0031]图2为不同提取剂下真菌毒素的回收率结果图；
[0032]图3为振荡提取采用的振荡器图；
[0033]图4为均质提取采用的均质器图；
[0034]图5为不同提取方式下真菌毒素的回收率结果图；
[0035]图6为C18吸附剂和正己烷联合净化的MRM谱图；
[0036]图7为PSA吸附剂和正己烷联合净化的MRM谱图；
[0037]图8为C18吸附剂、PSA吸附剂和正己烷联合净化的MRM谱图；
[0038]图9为乙腈和0.1％(v/v)甲酸水溶液作为流动相时的MRM谱图；
[0039]图10为乙腈和0.1％(v/v)甲酸
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乙酸铵水溶液(乙酸铵浓度为5mmol/L)作为流动相时的MRM谱图
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[004本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种饲料中真菌毒素的提取方法，包括以下步骤：将待测饲料与乙腈混合进行超声提取，将得到提取物溶解于甲醇中，得到甲醇复溶液；将所述甲醇复溶液依次进行吸附净化和正己烷洗涤，得到真菌毒素提取液；所述吸附净化用吸附剂包括C18吸附剂和PSA吸附剂；所述真菌毒素包括交链孢酚、交链孢烯、玉米赤霉烯酮、交链孢毒素II和腾毒素中的一种或几种。2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述待测饲料的质量与乙腈的体积之比为1g：5～10mL。3.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，所述待测饲料包括渔用饲料。4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述超声提取的功率≥600W，温度为40～45℃，时间≥30min。5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述待测饲料的质量与甲醇的体积之比为1g：0.5～1mL。6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述待测饲料和吸附剂的质量比为1：0.2～0.6。7.根据权利要求1或6所述的提取方法，其特征在于，所述C18吸附剂的粒径为40～50μm。8.根据权利要求1或6所述的提取方法，其特征在于，所述PSA吸附剂为乙二胺
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘慧慧，姜立生，张华威，张秀珍，黄会，王艺华，李焕霞，崔庆奎，薛敬林，韩典峰，田秀慧，丁玉竹，孙琰晴，崔艳梅，
申请(专利权)人：栖霞市检验检测中心烟台富美特信息科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：