一种通过快速检测底栖生物组成初步探测深海活动冷泉的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过快速检测底栖生物组成初步探测深海活动冷泉的方法，属于海洋技术领域。本发明专利技术方法包含如下步骤：S1：采集待测环境样本；S2：环境样本过滤与eDNA提取；S3：对eDNA进行PCR扩增与高通量测序；S4：根据测定序列进行OTU聚类；S5：对比NCBInt数据库，对OTU序列进行物种注释；S6：依据所统计的底栖生物物种信息，初步评估待测位点是否为活动冷泉，活动冷泉评估的标准为：注释信息中存在深海贻贝的注释序列，且该序列的read数量占所测样本总reads数的4％以上。与其他现有方法相比，本发明专利技术方法检测经济、简单，无需频繁使用ROV或MOV进行深海原位观测就能够对目标区域进行高通量、一次性检测鉴定大量的深海底栖生物物种，并根据物种组成信息，初步判定目标区域是否为活动冷泉。活动冷泉。活动冷泉。

【技术实现步骤摘要】
一种通过快速检测底栖生物组成初步探测深海活动冷泉的方法

：
[0001]本专利技术属于海洋
，具体涉及一种通过快速检测底栖生物组成初步探测深海活动冷泉的方法。

技术介绍
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[0002]冷泉分布于海底1000m及以下活动和被动的大陆边缘斜坡，主要包含水、甲烷为主的碳氢化合物、硫化氢等物质。在特定的温度和压力下，海底储存的天然气水合物和天然气会达到一种平衡状态，使得天然气从海底深处沿着一定的通道向海底表面扩散，并向上溢出从而形成活动冷泉。因此，活动冷泉常伴随着储量丰富的“可燃冰”(天然水合物)。“可燃冰”被认为是未来能够替代石油等传统化石燃料的新兴能源，具有重要的战略价值。同时，在活动冷泉区还常发现伴存在大量冷泉底栖生物，深海冷泉底栖生物中蕴藏着极其丰富的基因资源，对耐低温及重金属解毒等相关功能基因的挖掘与利用，能为生物医学、工业、环境、能源等领域产生重要的影响。
[0003]当前对活动冷泉探测的主要方法是首先基于地质、地球物理调查等前期研究工作，圈定潜在海底“冷泉”区，然后利用无人深潜器(ROV)或有人深潜器(MOV)对潜在目标海区进行逐一排查，这种方法要需利用ROV或MOV频繁下潜到海底进行现场的观测来确定是否为活动冷泉，存在耗时耗力且费用高等诸多不便。此外，活动冷泉底栖生物多样性的调查主要通过海底原位拍摄、肉眼辨识，室内逐个分析鉴定等技术手段，这些手段会遗漏一些不易被发现的物种；由于水深较深(通常超过1000m)，生物个体也较难获取、生物量难统计，耗时且效率低。基于以上活动冷泉探测及冷泉底栖生物多样性调查耗时、成本高且效率低的背景。

技术实现思路
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[0004]为了克服上述问题，本专利技术通过采集深海冷泉区原位底层水样，并对水样中的遗传物质进行高通量DNA测序并鉴定冷泉底栖物种组成，根据水环境样本中的物种组成初步探测目标区域是否为活动冷泉，本专利技术方法具有通量高、易于检测极大减少工作量的特点。
[0005]本专利技术的目的是提供一种通过快速检测底栖生物组成初步探测深海活动冷泉的方法，包括如下步骤：
[0006]S1：采集待测环境样本；
[0007]S2：环境样本过滤与eDNA提取；
[0008]S3：对eDNA进行PCR扩增与高通量测序；
[0009]S4：根据测定序列进行OTU聚类；
[0010]S5：对比NCBI nt数据库，对OTU序列进行物种注释；
[0011]S6：依据所统计的底栖生物物种信息，初步评估待测位点是否为活动冷泉，活动冷泉评估的标准为：样本中存在深海贻贝物种的注释序列，且该序列的read数量占所测样本
总read数量的4％以上。
[0012]优选地，步骤S1所述的环境样本为海底原位水环境样本。
[0013]优选地，步骤S2所述的环境样本过滤，是将处理水样采用无菌的孔径为0.45μm的水合纤维素滤膜过滤，并于液氮中保存。
[0014]优选地，步骤S3所述的PCR扩增，其引物为：
[0015]MlCOIintF：5
’‑
GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC
‑3’
；
[0016]JghHCO2198：5
’‑
TAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA
‑3’
。
[0017]优选地，步骤S3所述PCR扩增的条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。
[0018]优选地，步骤S3所述PCR扩增的体系为：5
×
FastPfu Buffer 4μl，2.5mM dNTPs 2μl，正反向引物各0.8μl，FastPfu Polymerase 0.4μl，Template DNA 10ng，ddH2O补齐至20μl。
[0019]优选地，步骤S3所述高通量测序，其原始数据优化的去杂方法和参数为：
[0020](1)过滤read尾部质量值20以下的碱基，设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50bp以下的read；
[0021](2)根据PE reads之间的overlap关系，将成对reads拼接(merge)成一条序列，最小overlap长度为10bp；
[0022](3)拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛除不符合的序列；
[0023](4)根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2；
[0024](5)用Usearch软件和gold数据库，采用de novo和reference结合的方式去除嵌合体。
[0025]优选地，步骤S4所述的根据测定序列进行OTU聚类是利用软件Vsearch 2.3.4对高质量序列在97％的相似性水平上进行聚类，产生可操作性分类单元(operational taxonomic units，OTUs)。
[0026]优选地，步骤S5所述对OTU序列进行物种注释的标准为：Identity>97％，E值<10
‑
100
。
[0027]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0028](1)检测经济、简单，无需频繁利用ROV或MOV进行原位观测；
[0029](2)能够高通量、一次性检测并鉴定大量冷泉底栖物种；
[0030](3)能够快速初步判定目标区域是否为活动冷泉区域。
附图说明
[0031]图1为活动冷泉伴随的冷泉生物深海贻贝(G.haimaensisi)在5个位点H1
‑
H5的read count。
[0032]图2为ROV原位调查验证，其中图A、B、C分别为活动冷泉区H1、H2及H3位点，伴生以深海贻贝为主的冷泉生物群落；图D、E分别为非活动冷泉区H4和H5位点，未发现冷泉底栖生物群落。
具体实施方式：
[0033]以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。
[0034]实施例1：活动冷泉的初步探测
[0035]1、首先基于地质、地球物理调查等前期研究工作，圈定潜在海底“冷泉”区。
[0036]2、对潜在目标区域水环境样本采集
[0037]2021年5月在琼东南海区选定5个潜在的冷泉区，利用取水器对5个待测站点(H1
‑
H5；(16.73
°
N,110.475
°
E))的底层水进行采样。每个站点3个重复，每个重复1L水体，共3L水样。使用无菌的孔径为0.45μm纤维素水合滤膜(上海新亚)对采集的水样进行过滤，过滤完成后用无菌镊子将每张滤膜单独放入25ml离心管中并于液氮中保存。使用OMEGA Water DNAkit(Omega，Norcr本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过快速检测底栖生物组成初步探测深海活动冷泉的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：采集待测环境样本；S2：环境样本过滤与eDNA提取；S3：对eDNA进行PCR扩增与高通量测序；S4：根据测定序列进行OTU聚类；S5：对比NCBI nt数据库，对OTU序列进行物种注释；S6：依据所统计的底栖生物物种信息，初步评估待测位点是否为活动冷泉，活动冷泉的评估的标准为：样本中存在深海贻贝物种的注释序列，且该序列的read数量占所测样本总read数量的4％以上。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1所述的环境样本为海底原位水环境样本。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2所述的环境样本过滤，是将处理水样采用无菌的孔径为0.45μm的水合纤维素滤膜过滤，并于液氮中保存。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3所述的PCR扩增，其引物为：MlCOIintF：5
’‑
GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC
‑3’
；JghHCO2198：5
’‑
TAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA
‑3’
。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3所述PCR扩增的条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3所述PCR扩增的体系为：5
×
Fas...

【专利技术属性】
技术研发人员：何毛贤，姚高友，张华，
申请(专利权)人：南方海洋科学与工程广东省实验室广州，
类型：发明
国别省市：