一种158位突变的醛酮还原酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种酿酒酵母来源的醛酮还原酶SceCPR半理性设计及其生物催化应用，属于蛋白质工程领域。本发明专利技术通过同源建模、分子比对和分子对接，提供了醛酮还原酶突变体，将序列表中氨基酸序列2所示的第158位丝氨酸突变为丙氨酸SceCPR

【技术实现步骤摘要】
一种158位突变的醛酮还原酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及醛酮还原酶突变体(SceCPR
S158A
)的构建和表达，以及该酶的性质和制备研究，属于基因工程和酶学研究


技术介绍

[0002]D
‑
泛酸(D
‑
Pantothenic acid,PA)又称维生素B5，存在于植物以及部分微生物中，具有多种生理功能。首先，泛酸作为能量物质参与代谢，不仅是大脑神经所必需的物质，还可以保持血液、皮肤和头发的健康。其次，泛酸作为辅酶A的合成前体，辅助脂肪酸和脂质的生物合成反应，D
‑
泛酸缺乏时会抑制辅酶A的生产，导致自由基清除效率和磷脂的合成效率下降，最终影响神经系统以及代谢功能的运转。
[0003]D
‑
泛解酸内酯(D
‑
Pantolactone,D
‑
PL)是合成D
‑
泛酸的重要前体物质，也可以用于合成异戊二烯、软体毒剂Cyanoide A大分子内酯化合物和D
‑
(
‑
)
‑
noviose等物质。D
‑
PL的合成方法包括化学法、酶法和化学酶法。D
‑
PL的化学合成法是以甲醛和异丁醛为起始原料，经醛缩合、腈化及内酯化等反应生成D/L
‑
PL，再经选择性拆分得到D
‑
PL，整个过程工艺成熟，但总体反应步数较多，反应条件严苛，且酸碱用量大和能耗较高。生物技术的发展为生物酶法合成D
‑
PL提供了重要的可行性。目前工业化合成D
‑
PL采用的是化学法与水解酶拆分法相结合的技术路线。即D/L
‑
PL在D
‑
泛解酸内酯水解酶作用下，选择性水解生成D
‑
泛解酸，D
‑
泛解酸再经内酯化生成D
‑
PL，而留下的L
‑
PL再经化学消旋化为D/L
‑
PL重新进行循环拆分。
[0004]氧化还原法催化不对称还原酮泛解酸内酯(Ketopantolactone,KPL)也可以用于制备D
‑
PL，具体的过程是D/L
‑
PL在L
‑
泛解酸内酯脱氢酶的作用下，将L
‑
PL氧化成KPL，再利用酮泛解酸内酯还原酶将其不对称还原成D
‑
PL。整个过程简单绿色，不需要化学法再消旋化。
[0005]早在1974年，King HL等人已经发现了一种来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的NADP(H)依赖型的酮泛解酸还原酶能够将KPL还原为D
‑
PL。1989年，Hata H等人从S.cerevisiae NRRL Y
‑
2034中发现了酮泛解酸内酯还原酶，并对其酶学性质进行了研究，发现其对醛酮类化合物靛红(Istain)及其衍生物具有非常高的亲和力，其中对KPL也具有较好的亲和力，K
m
值为0.017mM。NADPH依赖性的酮泛解酸内酯还原酶属于醛酮还原酶(aldo
‑
keto reductases，AKR)超家族。目前研究较多的CPR主要是源于Candida parapsilosis IFO 0708的CPR
‑
C1和CPR
‑
2，以及S.cerevisiae中的SceCPR。2014年，Qin HM等人对CPR
‑
C2的蛋白结构进行了解析，其结构由13个α螺旋和8个β折叠组成，并具有典型的磷酸丙糖异构酶结构口袋，属于典型AKR家族蛋白。Qin HM等人进一步又提出了CPR
‑
C2的分子作用机制，揭示了其四个关键的催化位点Asp58、Tyr63、Lys88和His125，其中Tyr63与His125作为质子供体，Tyr63与Lys88形成的带电氢键促进了Tyr63的质子转移；Lys88与Asp58之间形成盐桥实现整个催化过程，此外，还揭示了CPR
‑
C2辅酶结合位点(Gly26、Thr27、Ser161、Ser215、Leu217、Arg222、Thr260、Thr261)。
[0006]2017年，Zhao M等人通过构建“一菌双酶”辅酶循环再生体系生产D
‑
PL，为抑制底物KPL的自发性水解，将底物以酸性条件流加入反应中，最终产物浓度达到475mM，得率在95％左右，e.e.≧99.9％，产物的时空得率为243.45g
·
L
‑1d
‑1。2020年，Pei X等人，利用二氯甲烷抑制KPL的自发性水解，开发了一种双相反应体系进行全细胞生物转化生产D
‑
PL。在分批补料双相反应中，D
‑
PL的产物浓度为0.77mol/L，其e.e.≧99％，时空产率为343.2g
·
L
‑1d
‑1。
[0007]但是由于泛酸及其相关产品的重要性，在工业上仍需要进一步提高D
‑
PL生产效率，降低其合成成本，还需要进一步提升SceCPR的催化活性。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是通过分子对接和定向进化技术，提供一种与野生型相比，比酶活更高的醛酮还原酶的定向改造酶。
[0009]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0010]第一方面，本专利技术提供一种醛酮还原酶突变体，所述突变体是将SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的第298位进行单突变或第158位、第298位进行双突变获得的。
[0011]具体地，所述突变体是将SEQ ID NO：2所示氨基酸序列进行如下之一的突变获得：(1)第298位的酪氨酸突变成组氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；(2)第158位丝氨酸、第298位酪氨酸分别突变为丙氨酸、组氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
[0012]第二方面，本专利技术提供一种上述醛酮还原酶突变体的编码基因。所述编码基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7所示。
[0013]第三方面，本专利技术提供一种含上述编码基因的重组表达质粒。
[0014]优选地，所述的重组表达质粒的载体为pEASY
‑
Blunt E1。所述重组表达质粒是将所述编码基因插入pEASY
‑
Blunt E1质粒的多克隆位点(multiple cloning sites，MCS)得到。
[0015]进一步所述重组表达质粒按如下方法构建：
[0016](1)以含有质粒pACYCDuet1
‑
SceCPR/EsGDH的E.coli DH5α菌株为模板，以下列引物进行PCR扩增，对PCR产本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种醛酮还原酶突变体，其特征在于：所述突变体是将SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的第158位进行单突变获得的。2.如权利要求1所述的醛酮还原酶突变体，其特征在于：所述突变体是将SEQ ID NO：2所示氨基酸序列进行如下突变获得：第158位丝氨酸突变为丙氨酸。3.如权利要求1所述的醛酮还原酶突变体的编码基因。4.含如权利要求1所述的编码基因的重组表达质粒。5.如权利要求4所述的重组表达质粒，其特征在于：所述的重组表达质粒的载体为pEASY
‑
Blunt E1，所述重组表达质粒是将所述编码基因插入pEASY
‑
Blunt E1质粒的多克隆位点得到。6.如权利要求5所述的重组表达质粒，其特征在于所述重组表达质粒按如下方法构建：(1)以含有质粒pACYCDuet1
‑
SceCPR/EsGDH的E.coli DH5α菌株为模板，以下列引物进行PCR扩增，对PCR产物进行纯化回收，得到目的基因：SceCPR
‑
F TCATCATCATATGGGCTCATTTCATCAGCAGSceCPR
‑
R GTTATGCTAGTCACACTTTCTGGGCCGC所述质粒pACYCDuet1
‑
SceCPR/EsGDH是将GenBank登录号为EGA59421.1的基因、GenBank登录号为KM817194.1的基因分别插入同一质粒pACYCDuet
‑
1的酶切位点Nco I与Hind III之间、Nde I与Xho I之间得到的；(2)以pEASY
‑
Blunt E1质粒为模板，以下列引物进行PCR扩增，对PCR产物进行纯化回收，得到线性化载体：pEASY
‑
Blunt E1
‑
F GAAAGTGTGACTAGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，赵嫚，王美南，刘薇，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：