区域分层的软骨细胞层片的制备方法及其用途技术

本发明专利技术提供一种制备区域分层的软骨细胞层片的方法，该方法包含以下步骤：（a）提供来自对象的软骨样本；（b）从所述软骨样本中分离出软骨细胞，再从所述软骨细胞分离出浅层区软骨细胞、中层区软骨细胞、及深层区软骨细胞；（c）培养所述深层区软骨细胞直至细胞满盘以形成深层区软骨层片；（d）接种所述中层区软骨细胞到所述深层区软骨层片上，并培养所述中层区软骨细胞直至细胞满盘以形成中层区软骨层片；及（e）接种所述浅层区软骨细胞到所述中层区软骨层片上，并培养所述浅层区软骨细胞直至细胞满盘以形成浅层区软骨层片，来获得所述区域分层的软骨细胞层片。的软骨细胞层片。的软骨细胞层片。

【技术实现步骤摘要】
区域分层的软骨细胞层片的制备方法及其用途


[0001]本专利技术涉及一种制备软骨细胞层片的方法，其特征在于，从对象中取得的软骨样本中分离出软骨细胞，并从所述软骨细胞分离出浅层区软骨细胞、中层区软骨细胞、及深层区软骨细胞，再将上述三种软骨细胞分别进行细胞增殖，然后按顺序先以深层区软骨细胞建构深层区软骨层片，再在其上面植入中层区软骨细胞建构中层区软骨层片，最后再植入浅层区软骨细胞来建构浅层区软骨层片，从下到上堆叠以构建出具有三层结构的层片。

技术介绍

[0002]关节软骨由于没有血管与神经组织以及低细胞基质比的特性，一旦损伤后非常难以自我修复。关节软骨损伤通常导致退行性关节疾病的早期发作。到目前为止，实现软骨组织功能的完整修复仍面临重大挑战。自体软骨细胞移植（autologous chondrocyte implantation，ACI）目前是一种很有前景的治疗策略，也是美国食品药物管理局（FDA）批准的唯一一种基于细胞的治疗软骨损伤的治疗方法。与传统的微骨折（microfracture）方法相比，自体软骨细胞移植在一些临床病例中已经成功地再生出透明样（hyaline
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like）新软骨。微骨折方法因其简单性和低成本而被广泛使用，然而此方法仅对小病变有效，且因为形成的是纤维软骨而不是透明关节软骨，仅能提供相对短期的功能改善。在近期研究中，对于更大的缺损及/或更严重的基线症状（baseline symptom），自体软骨细胞移植方法已被证明比微骨折更有效。
[0003]考虑天然关节软骨和重建复杂的区域组织对于设计合适的功能性组织修复策略至关重要。关节软骨由含有丰富的胶原纤维及蛋白聚糖（proteoglycan, PG）的基质组成，其中嵌有能生成软骨细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的软骨细胞。关节软骨分为浅层区（superficial zone，SZ）、中层区（middle zone，MZ）、及深层区（deep zone，DZ）三个区域，各具有不同的细胞形态和密度、细胞外基质结构排列、组织复杂性、及生物力学特性。浅层区（由软骨上方的10
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15%组成）含有相对高密度及扁平的软骨细胞，其中胶原纤维平行于关节表面。浅层区的软骨细胞以相对较低的速率产生糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG），并分泌一种特定的浅层区蛋白（superficial zone protein，SZP），该蛋白在关节运动过程中起到使滑动流畅的作用。中层区（表面至总软骨厚度的40
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50%）含有更多圆形软骨细胞及随机方向的胶原纤维。深层区（总软骨厚度的30
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40%）由呈垂直柱状排列的大软骨细胞及垂直于关节表面排列的胶原纤维所组成。深层区中存在几种标记，例如在关节软骨最深层中表达的Notch
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Delta信号传导通路及X型胶原蛋白。胶原纤维以II型胶原蛋白（collagen type II，Col 2）和聚集蛋白聚糖（aggrecan，Aggr）为主，但也含有其他次要的IX型胶原蛋白（collagen type IX，Col 9）及XI型胶原蛋白，它们在调节纤维大小、纤维间交联、以及与蛋白聚糖的相互作用方面很重要。由于胶原蛋白和蛋白聚糖结构排列的差异，导致生物力学特性的区域性差异显著，包括与软骨深度相对应的拉伸、压缩、及剪力特性。此外，软骨的特定区域结构在调节对不同软骨组织层的适当信息传递方面也很重要。例如，保留软骨表层不仅对软骨的完整性和降低关节软骨表面的摩擦很重要，而
且对调节深层区软骨细胞的增殖和代谢活动也很重要。然而，自体软骨细胞移植策略通常植入浅层、中层、深层混合在一起的软骨细胞在生物材料支架上，因此，以前软骨组织工程所构建的再生软骨通常是同质的而无分层结构，缺乏其天然浅层、中层、深层的结构。
[0004]回顾先前的研究可以得知，如果能重建天然关节软骨的分层特征，就可以增强新软骨的机械性能并保持再生软骨的长期功能。近年来就有研究尝试利用无支架和无基质、基于支架/基质、及混合方法等技术来制造具有区域分层的关节软骨。其中，最简单的就是微量颗粒培养法，颗粒确实会形成细胞和基质的区域组织，糖胺聚糖的含量通常从外表面向中心增加。然而，这种方法不适合直接应用于临床治疗，因为颗粒很小，区域变化是球形的而非取决于深度，无法修复大于一平方厘米的软骨缺损。而支架/基质方法仍然有支架孔径和互连性的控制问题，以及难以将细胞均匀地植入支架中（通常在外围显示高细胞密度，在中心显示低细胞密度）；而且支架对身体来说是一种异物，可能会引起严重的炎症及免疫反应。另外，有研究尝试使用具有硬度梯度或成分梯度的水凝胶来植入区域特异性软骨细胞来构建分层框架，然而这种方法在临床实践中经常发生各分层之间因连接较弱而剥离。为了克服上述问题，一种最为可行的方法是利用细胞层片技术，因为细胞层片技术有助于有效堆叠不同区域的软骨细胞，且它的无支架特性不会引起炎症反应并能消除免疫排斥的风险。最近，细胞层片已被应用于再生医学，例如心肌、角膜、及肾细胞的再生。此外，该技术也已被开发用于制造修复关节软骨缺损的软骨细胞层片，但之前的软骨细胞层片并不具有浅层、中层、深层的结构。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种制备区域分层的软骨细胞层片的方法，该方法包含以下步骤：（a）提供来自对象的软骨样本；（b）从所述软骨样本中分离出软骨细胞，再从所述软骨细胞分离出浅层区软骨细胞、中层区软骨细胞、及深层区软骨细胞三种软骨细胞；（c）接种所述深层区软骨细胞到培养皿中的培养基内，并培养所述深层区软骨细胞直至达到细胞满盘以形成深层区软骨层片；（d）接种所述中层区软骨细胞到步骤（c）所培养形成的深层区软骨层片上，并培养所述中层区软骨细胞直至达到细胞满盘以形成中层区软骨层片；及（e）接种所述浅层区软骨细胞到步骤（d）所培养形成的中层区软骨层片上，并培养所述浅层区软骨细胞直至达到细胞满盘以形成浅层区软骨层片，来获得具有深层区软骨层片、中层区软骨层片、及浅层区软骨层片的所述区域分层的软骨细胞层片。
[0006]本专利技术旨在利用细胞层片技术，通过将软骨细胞先分离为浅层区软骨细胞、中层区软骨细胞、及深层区软骨细胞三种群体，再利用细胞层片技术来制造具有分层结构的再生软骨。
[0007]本专利技术使用Percoll非连续性密度梯度离心法，从软骨细胞中分选出浅层区软骨细胞、中层区软骨细胞、及深层区软骨细胞三种软骨细胞，以重建天然关节软骨的分层结构，该结构被认为是在修复的关节软骨中重现生物力学特性及获得长期组织完整性所需的关键因素。如图1所示，从远端股骨软骨中获得的软骨细胞被分成具有形态及表型差异的三层细胞。最上面的部分主要来自关节软骨的深层区，含有较大的细胞及高浓度的蛋白聚糖。相较之下，最下面部分的细胞来自浅层区，其细胞最小，蛋白聚糖浓度相对较低，分裂速度比来自中层区及深层区的细胞慢。此外，通过检测与不同软骨区域相关的细胞外基质标记
和分泌蛋白，本专利技术证实了密度梯度分类的亚群的个别的软骨形成本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备区域分层的软骨细胞层片的方法，所述方法包含以下步骤：（a）提供来自对象的软骨样本；（b）从所述软骨样本中分离出软骨细胞，再从所述软骨细胞分离出浅层区软骨细胞、中层区软骨细胞、及深层区软骨细胞；（c）接种所述深层区软骨细胞到培养皿中的培养基内，并培养所述深层区软骨细胞直至达到90
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100%细胞汇合以形成深层区软骨层片；（d）接种所述中层区软骨细胞到步骤（c）所培养形成的深层区软骨层片上，并培养所述中层区软骨细胞直至达到90
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100%细胞汇合以形成中层区软骨层片；以及（e）接种所述浅层区软骨细胞到步骤（d）所培养形成的中层区软骨层片上，并培养所述浅层区软骨细胞直至达到90
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100%细胞汇合以形成浅层区软骨层片，来获得具有所述深层区软骨层片、所述中层区软骨层片、所述浅层区软骨层片的所述区域分层的软骨细胞层片。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述软骨样本是关节软骨样本。3.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：田英俊，
申请(专利权)人：高雄医学大学，
类型：发明
国别省市：