一种用于炎症性疾病治疗的重组腺相关病毒及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种用于炎症性疾病治疗的重组腺相关病毒及其构建方法和应用，所述重组腺相关病毒以腺相关病毒为载体，其包含一个到多个拷贝的功能性DNA片段DMP

【技术实现步骤摘要】
一种用于炎症性疾病治疗的重组腺相关病毒及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及炎症基因治疗生物
，具体涉及一种重组腺相关病毒及其 在炎症性疾病治疗中的应用。

技术介绍

[0002]炎症是机体对感染和身体损伤的保护性反应。适度的炎症反应有助于维持体 内的稳态。然而，异常的炎症反应会导致炎症性疾病。例如，一些传染性病原体 可导致全身炎症，可能导致败血症、细胞因子释放综合征、急性呼吸窘迫综合征， 甚至多器官功能衰竭。一些持续性感染会导致慢性炎症以及癌症高风险诱发，例 如乙型肝炎病毒引起的肝炎和肝癌。许多慢性炎症是由适应性免疫异常变化引起 的，从而导致了各种自身免疫性疾病，如关节炎、炎性肠病、狼疮、银屑病、皮 炎、哮喘、多发性硬化、脂肪性肝炎，甚至动脉粥样硬化、糖尿病、神经退行性 疾病和炎性衰老。此外，先天免疫的许多异常变化还会诱发各种自身炎症性疾病。 因此，异常炎症对人类健康构成了广泛而严重的威胁。
[0003]为了治疗炎症性疾病，这些疾病相关的分子机制被广泛研究。目前已经明确 了它们的基础信号通路(例如NF
‑
κB和JAK
‑
STAT)以及主要的参与分子，其 中许多潜在的靶点被尝试用于抗炎药物的开发。迄今为止，许多药物已被应用来 治疗各种炎症性疾病，例如广泛使用的皮质类固醇(如糖皮质激素)。同时许多 抗炎生物制剂也陆续被研发，例如细胞因子单克隆抗体(如促炎细胞因子TNF
‑
α、 IL
‑
1α、IL
‑
1β、IL<br/>‑
5、IL
‑
6、IL
‑
12、IL
‑
17A、IL
‑
17F、IL
‑
23和抗炎细胞因子IL
‑
4、 IL
‑
10、IL
‑
11、IL
‑
13、TGFβ)、细胞因子受体的抗体或拮抗剂(例如IL
‑
6R、IL
‑
5Rα、 IL
‑
4Rα)和CD抗体(例如CD4、CD14、CD19、CD20、CD38、CD40)。JAK 小分子抑制剂(JAK1、JAK2、JAK3、TYK2)则是迅速发展起来的有前景的新 型抗炎药。毫无疑问，目前的消炎药已经让患者受益匪浅。然而，抗炎药物仍面 临几个关键性的挑战，比如原发性无应答、耐药或者响应丢失、复发和多种副作 用。因此，当前的治疗方法还远远未能满足炎症性疾病临床治疗的需求。
[0004]NF
‑
κB是一个序列特异性DNA结合转录因子家族，包括RelA/p65、p50、p52、 RelB和c
‑
Rel，在炎症中起关键调节作用。被多种诱导剂诱导之后,活化的NF
‑
κB (主要是RelA
‑
p50异二聚体)可以通过直接结合启动子和增强子来诱导靶基因 的表达，从而参与细胞增殖、凋亡、先天免疫反应等过程。其中，NF
‑
κB能直接 调节多种炎症基因的表达，包括粘附因子(如ICAM
‑
1、VCAM
‑
1)、细胞因子(如 IL
‑
1α、IL
‑
1β、IL
‑
2、IL
‑
6、IL
‑
8、IL
‑
10、IL
‑
11、IL
‑
12、IL
‑
13、IL
‑
15、IL
‑
17、 IL
‑
23、TNFα、IFNβ、IFNγ)和趋化因子(例如CCL5、CCL17、CCL19、CCL20、 CCL22、CCL23、CCL28)。诱骗寡核苷酸和小干扰核酸(siRNA)也曾被作为 NF
‑
κB的候选抑制剂。但是由于其活性不可控、递送困难、易降解，这两种NF
‑
κB 抑制剂在临床试验中也未能成功。为了克服它们的局限性，申请人前期开发了一 种新的NF
‑
κB抑制剂分子：一种结合了NF
‑
κB诱骗子和microRNA序列的质粒 载体DMP
‑
miR533(Int.J.Biochem.Cell.Biol.2018,95:43
‑
52；专利号 ZL201710812983.2)。
[0005]申请人前期技术中已经在体外培养的细胞上初步论证DMP
‑
miR533质粒载 体可感知并抑制细胞内的NF
‑
κB活性，但质粒载体本身目前还不能直接用于动 物体内给药，也是说该种质粒载体无法实现体内细胞的转染和NF
‑
κB活性的控 制。此外，炎症本身不是体外某种细胞的行为，而是哺乳动物活体水平的一种生 理或病理反应。因此，在体外培养细胞中可感知和控制NF
‑
κB活性的 DMP
‑
miR533是否能够在哺乳动物活体上控制NF
‑
κB活性并实现炎症的治疗， 仍是未知。此外，体外培养的细胞是一种非常单纯的人工可控的环境，与具有复 杂生命系统的哺乳动物活体的体内生理及病理环境无法相提并论。这就是为什么 很多富有希望的候选药物分子在临床实验上都无法成为药物的与原因。因此，为 了论证和开发DMP
‑
miR533在哺乳动物活体上控制NF
‑
κB活性并实现炎症的治 疗的可能性，为人类的炎症治疗探索新的技术。

技术实现思路

[0006]专利技术目的：针对现有炎症治疗存在的问题，本专利技术提供一种新型重组腺相关 病毒，该病毒可通过抑制细胞内NF
‑
κB活性实现哺乳动物活体上炎症疾病的治 疗，有望用于制备新型生物药物，用于人类炎症性疾病的治疗。
[0007]本专利技术还提供所述重组腺相关病毒的构建方法和应用。
[0008]技术方案：为了实现上述目的，本专利技术提出一种用于炎症性疾病治疗的重组 腺相关病毒，所述重组腺相关病毒rAAV
‑
DMP
‑
miR533以腺相关病毒为载体，其 包含一个到多个拷贝的功能性DNA片段DMP
‑
miR；所述功能性DNA片段 DMP
‑
miR由两个功能元件DMP和miR构成，其中DMP为NF
‑
κB特异性启动 子，所述miR为编码可靶向NF
‑
κB mRNA的microRNA。
[0009]其中，所述DMP为NF
‑
κB特异性启动子，由一个NF
‑
κB诱骗子和一个最 小启动子组成，该DMP包括各种序列的NF
‑
κB诱骗子和最小启动子。
[0010]作为优选，所述DMP的序列(SEQ ID NO.1)为5'
‑
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于炎症性疾病治疗的重组腺相关病毒，其特征在于，所述重组腺相关病毒rAAV
‑
DMP
‑
miR533以腺相关病毒为载体，其包含一个到多个拷贝的功能性DNA片段DMP
‑
miR；所述功能性DNA片段DMP
‑
miR由两个功能元件DMP和miR构成，其中DMP为NF
‑
κB特异性启动子，所述miR为编码可靶向NF
‑
κBmRNA的microRNA。2.根据权利要求1所述的用于炎症性疾病治疗的重组腺相关病毒，其特征在于，所述DMP为NF
‑
κB特异性启动子，由一个NF
‑
κB诱骗子和一个最小启动子组成，该DMP包括各种序列的NF
‑
κB诱骗子和最小启动子。3.根据权利要求2所述的用于炎症性疾病治疗的重组腺相关病毒，其特征在于，所述DMP的序列为5'
‑
GGG AAT TTC CGG GGA CTT TCC GGG AAT TTC CGG GGA CTT TCC GGG AAT TTC CTA GAG GGT ATA TAA TGG AAG CTC GAC TTC CAG
‑
3'。4.根据权利要求1所述的用于炎症性疾病治疗的重组腺相关病毒，其特征在于，所述miR包括编码靶向NF
‑
κB家族成员RELA、RELB或CREL的microRNA。5.根据权利要求4所述的用于炎症性疾病治疗的重组腺相关病毒，其特征在于，所述miR编码靶向NF
‑
κB家族成员RELA的人工microRNA；所述miR编码miR533，其中miR533的序列为5
′‑
CAA AGA TGG GAT GAG AAA GGA
‑3′
。6.根据权利要求1所述的用于炎症性疾病治疗的重组腺相关病毒，其特征在于，所述功能性DNA片段DMP
‑
miR被重组腺相关病毒导入细胞后，其功能元件DMP可结合细胞核内的转录因子蛋白NF
‑
κB，从而激活miR的表达。7.根据权利要求3所述的用于...

【专利技术属性】
技术研发人员：王进科，罗涛，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：