一种湿盒碎片贴壁自体成纤维细胞培养方法技术

本发明专利技术提供了一种湿盒碎片贴壁自体成纤维细胞培养方法，包括将皮肤组织处理为组织碎片贴于培养瓶中进行湿盒贴壁培养的步骤。本方法免去胰蛋白酶消化对细胞的损伤，以细小碎片的方式，将皮肤组织均匀贴附于培养瓶中，在相同组织大小的条件下，最大程度提高组织贴壁面积和贴壁效率；采用湿盒贴壁法，可以保持培养瓶内湿度，减少细胞干燥死亡，延长组织贴壁时间，降低贴壁时间控制的难度，提高组织贴壁的成功率；优化组织间隔，最大化细胞间相互作用，促进增殖，并使用无血清的成纤维细胞完全培养基培养，在体外培养阶段避免伦理问题。在体外培养阶段避免伦理问题。在体外培养阶段避免伦理问题。

【技术实现步骤摘要】
一种湿盒碎片贴壁自体成纤维细胞培养方法
专利
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[0001]本申请涉及细胞培养，特别是自体成纤维细胞培养
具体地，本申请提供了一种湿盒碎片贴壁自体成纤维细胞培养方法。

技术介绍
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[0002]成纤维细胞是真皮组织中最主要的组成部分，在伤口的愈合过程中起到至关重要的作用。成纤维细胞在皮肤修复和再生中的潜力逐渐被认识，如：体外培养并通过基因转染将其诱导转化为“类心肌细胞”对慢性心力衰竭进行细胞移植治疗成为热点；自体成纤维细胞移植通过分泌生长因子及细胞因子促进伤口再上皮化、细胞外基质形成、抑制疤痕增长，对烧伤和糖尿病足的治疗起到非常显著的效果。自体真皮成纤维细胞诱导了皮肤功能的正常恢复和最小的瘢痕。与同种异体真皮成纤维细胞相比，移植自体真皮成纤维细胞具有更好的生存能力，促进了伤口的再上皮化和伤口愈合。
[0003]改善法令纹、面部松弛、除皱、雄激素性脱发等长期以来都是以手术治疗作为主要手段，其效果虽然持久，然而术后长时间的恢复期，和术后并发症如：瘢痕，术后水肿及感染等都给求美者带来了很大不便。因此对于微创治疗的需求随之增加，如今越来越多的填充材料及药物应用于临床，肉毒素以及如透明质酸等美容填充材料被广泛开发。然而因为填充材料在注射部位的吸收、代谢，因此需要不断地定期进行注射才能维持效果。此外如；过敏、皮肤色素沉淀、皮下结节、栓塞等并发症也是填充治疗的一大难题。成纤维细胞在皮肤结构和完整性中起到至关重要的作用。使用自体成纤维细胞作为填充物注射到真皮，可以有效的避免异体填充物所导致的过敏，并且自体成纤维细胞持续分泌的胶原蛋白和各种细胞外基质蛋白可以使治疗的持续时间大大延长。
[0004]自体成纤维细胞作为一种细胞治疗的方法，安全性是有所保证的。2011年，FDA批准将自体成纤维细胞注入真皮，以改善成年人中度至严重的面部鼻唇沟皱纹的外观(LAVIV，Fibrocell Technologies，Exton，PA，USA)。在欧洲，自体成纤维细胞疗法被认为是一种具有医院豁免的高级治疗药物产品(ATMP
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HE)，符合医药产品要求的药品自体小规模非常规细胞治疗的生产不需要EMA(欧洲药品管理局)的集中上市许可。目前研究表明，成纤维细胞具有极强的稳定性，在培养中增殖后仍然保持其功能特性。自体成纤维细胞注射入体内后不会形成肿瘤样生长或诱发肿瘤。
[0005]目前成纤维细胞常规培养方法分为消化法和组织块法。消化法操作复杂，组织需求量大，胰酶和胶原酶消化会对细胞造成极大损伤，导致细胞增殖能力和活性降低，培养成纤维细胞纯度较低。组织块法中组织块过大，浪费组织并不利于细胞爬出。此外贴壁过程容易干燥，不易掌控组织块贴壁时间，导致细胞尚未贴壁或干枯死亡。此外常规培养过程，成纤维细胞培养基中含有的胎牛血清应用于细胞增殖培养，也会增免疫排斥等风险。
[0006]成纤维细胞在体外培养随着时间，其形态及细胞功能都会发生改变，培养所需时间越久细胞的转化就会愈加明显。并且原代细胞培养时间长短，极大程度影响细胞的增殖、分泌细胞外基质的能力。本方法极大程度增加组织利用率，缩短培养时间，提高培养效率。
对于维持成纤维细胞表型及功能，以及后续自体血清培养自体成纤维细胞提供了更为可靠的基础。此外免去血清的使用，可以有效提高自体细胞移植中所用细胞的安全性，减少和杜绝自体移植过程中免疫排斥等危险，并大大降低培养成本。目前自体细胞移植需求火爆，价格高昂，相较自体细胞培养成本，具有极大利润空间；此外培养过程无需过多人工成本，培养周期更短，具有极高经济效益。

技术实现思路

[0007]本专利技术针对现有胰酶消化法及组织块贴壁法现有的技术缺陷，提供了一种在较少组织情况下，避免使用胰蛋白酶损伤组织样本，提高原代成纤维细胞增殖活性及培养成功率，降低原代成纤维细胞增殖过程中细胞衰老程度，高效获取大量未衰老的自体成纤维细胞的培养方法。
[0008]一方面，本申请提供了一种湿盒碎片贴壁自体成纤维细胞培养方法，包括将皮肤组织处理为组织碎片贴于培养瓶中进行贴壁培养。
[0009]进一步地，所述贴壁培养在湿盒中进行。
[0010]进一步地，所述贴壁培养中将组织碎片贴壁的培养瓶倒置，在贴壁之前向倒置培养瓶的下部中加入培养基。
[0011]进一步地，所述组织碎片大小为0.1mm*0.1mm
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0.5mm*0.5mm。
[0012]进一步地，所述组织碎片大小为0.2mm*0.2mm。
[0013]进一步地，将所述组织碎片间隔1mm
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5mm贴于培养瓶中。
[0014]进一步地，将所述组织碎片间隔3mm贴于培养瓶中。
[0015]进一步地，所述方法包括用含青霉素或链霉素的无菌缓冲液的容器转移皮肤组织的步骤；以及用含青霉素或链霉素的无菌缓冲液清洗并减去多余组织的步骤。
[0016]进一步地，所述方法包括将培养瓶倒置后，加入成纤维细胞无血清完全培养基培养的步骤。
[0017]进一步地，加入的培养基为4ml成纤维细胞无血清完全培养基。
[0018]进一步地，所述培养在5％CO2，37℃培养箱中进行。
[0019]另一方面，本申请提供了上述方法在制备美容用、伤口治疗用成纤维细胞中的用途。
[0020]本申请中的皮肤组织可取各种皮肤组织，不限于实施例中所示的眼部皮肤组织。
[0021]由于实际操作条件的制约，本申请中的组织碎片大小为约数，本领域技术人员可以通过适当的操作来提供所需的组织碎片大小。
[0022]本申请中的“湿盒”是指基本密闭的，用于培养细胞的培养瓶容器。本申请中的“湿盒”引用了“免疫组化中湿盒”的原理，将组织碎片贴壁的培养瓶倒置，并将本应于贴壁结束后加入的培养基，提前加入到细胞贴壁面朝上的倒置培养瓶中，以确保贴壁过程中的环境湿润，保护细胞碎片中的细胞在贴壁过程中免受二次损伤。
[0023]本申请中所述的美容包括但不限于出于医疗目的或者非医疗目的处理法令纹、皮肤松弛、皱纹、脱发等的方法。
[0024]本申请中的自体成纤维细胞包括各种来源和种类的自体成纤维细胞；本申请中的“自体”是指成纤维细胞来源为取自人或动物个体的成纤维细胞，而非市售或者保藏的细
胞。“自体”并不限定整个培养过程必须依赖于具体个体的细胞来完成，即本申请的方法完全可以在产业上应用。
[0025]与现有的贴壁培养法相比，本专利技术将皮肤组织块处理为碎片贴于培养瓶中进行贴壁，最大程度提高组织贴壁面积和贴壁效率，使得培养所需组织样本量远小于常规培养方法。此外常规贴壁法由于组织块过大，贴壁时间不易掌控，时间过短，则加入培养基后组织块漂浮，细胞无法爬出生长；时间过长，则组织块干枯，细胞坏死。为解决上述问题，本方法使用湿盒法贴壁进行细胞培养，可以保持培养瓶内湿度，减少细胞干燥死亡，延长组织贴壁时间，降低贴壁时间控制的难度，提高组织贴壁的成功率。此外本方法优化组织间隔，最大化细胞间相互作用，促进增殖，抵抗原代细胞提取与增殖过程中的细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种湿盒碎片贴壁自体成纤维细胞培养方法，其特征在于，所述方法包括将皮肤组织处理为组织碎片贴于培养瓶中进行贴壁培养。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述贴壁培养在湿盒中进行。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述贴壁培养中将组织碎片贴壁的培养瓶倒置，在贴壁之前向倒置培养瓶的下部中加入培养基。4.根据权利要求1
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3任一项所述的方法，其中所述组织碎片大小为0.1mm*0.1mm
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0.5mm*0.5mm。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述组织碎片大小为0.2mm*0.2mm。6.根据权利要求1
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5任一项所述的方法，其中将所述组织碎片间隔1mm
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5mm贴于培养瓶中。7.根据权利要求6所述的方法，其中将所述组织碎片间隔3mm贴于培养瓶中。8.根据权利要求1<...

【专利技术属性】
技术研发人员：林煌，马嘉兴，赵银花，崔玥，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京安贞医院，
类型：发明
国别省市：