制备水凝胶支架的方法及由此得到的支架的用途技术

本发明专利技术涉及一种利用自组装多肽制备水凝胶支架的方法及由此得到的支架的用途，制备方法包括：1）将自组装肽序列通过共价键键合神经生长因子模拟肽得到键合功能多肽；2）分离并培养巨噬细胞，并诱导其为“替代性激活”的抗炎M2巨噬细胞，获得培养上清液并进行过滤，得到经过滤的细胞培养上清液；3）将经过滤的细胞培养上清液与键合功能多肽混合，得到混合液并调整该混合液的浓度，所述键合功能多肽自组装形成水凝胶支架。本发明专利技术采用M2巨噬细胞条件培养上清液构建再生微环境，结合多肽功能水凝胶支架，实现较好的整体相互作用，制备得到可以补充和调节神经再生的水凝胶支架，该支架可以促进神经细胞再生行为，为组织工程生物材料提供新的选择。新的选择。新的选择。

【技术实现步骤摘要】
制备水凝胶支架的方法及由此得到的支架的用途
[0001]本申请是申请日为2021年7月27日、名称为“制备水凝胶支架的方法及由此得到的支架的用途”的申请号为202110849059.8的专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术涉及组织工程
，更具体而言，涉及一种利用自组装多肽制备水凝胶支架的方法以及由此得到的支架的用途。

技术介绍

[0003]周围神经损伤的主要原因包括交通事故、机械创伤、自然灾害和手术意外。我国周围神经损伤病例每年新增约100万例，所照成难以恢复的残疾严重影响患者的生活质量和心理健康，为家庭和社会带来了沉重的经济负担。同时，本领域已知人工神经植入物的修复效果与自体神经相比还有差距，通过局部再生微环境调控提高植入物的功能，是能否实现临床应用的关键问题。
[0004]组织工程技术的出现，为损伤神经修复提供了技术方式。组织工程包括三个要素：支架、种子细胞和信号因子。其中支架对于不仅对于再生组织起到物理连接和支持作用，而且在调控细胞再生环境发挥了重要作用。水凝胶的三维网络结构具有含水量高、适宜细胞生长的特点，通过交联生长因子模拟肽进一步提高了细胞生长环境，因此，如何成功地构建能够良好地模拟体内微环境的支架材料，对于损伤神经再生而言具有重要意义。
[0005]巨噬细胞在体内分布极广，在调节炎症过程中发挥着巨大作用，具有高度可塑性，并在机体的发育及内环境的平衡中起到重要作用。巨噬细胞发生极化为M2表型后，极化后的巨噬细胞亚型可以细致调节及回应各种不同的刺激，分泌信号因子，抗慢性炎症，促进组织修复再生，对疾病组织器官的修复程度起着关键性的作用。关于M2巨噬细胞衍生的细胞外基质构建水凝胶支架的研究还未见报道，具有重要的研究价值。

技术实现思路

[0006]本专利技术的一个方面是提供一种自组装多肽水凝胶支架制备方法，其中，所述方法包括：（1）将自组装肽序列通过共价键键合神经生长因子模拟肽，得到键合功能多肽；（2）分离并培养巨噬细胞，并诱导其为“替代性激活”的抗炎M2巨噬细胞，得到细胞培养上清液并进行过滤，得到经过滤的细胞培养上清液；（3）将所述经过滤的细胞培养上清液与所述键合功能多肽混合，得到混合液并调整所述混合液的浓度，所述键合功能多肽自组装形成水凝胶支架。
[0007]优选地，神经生长因子模拟肽具有促进神经血管细胞再生的功能。
[0008]优选地，自组装肽序列与神经生长因子模拟肽通过酰胺键或二硫键共价连接。
[0009]优选地，自组装肽序列与神经生长因子模拟肽摩尔比为（1~3）：1。
[0010]优选地，巨噬细胞来自大鼠/小鼠腹腔或骨髓、或人外周血单个核淋巴细胞中的一
种。
[0011]优选地，步骤（2）所述培养在30℃~40℃、3%~10% CO2的条件下进行；进一步优选地，所述培养的过程包括：将所述巨噬细胞在培养基中生长至60%~80%的汇合度后，弃去培养液并利用PBS缓冲液进行洗涤，随后向洗涤后的培养物中加入新鲜培养基并继续培养36h以上、例如36~72h、优选40~50h；优选地，采用孔径为0.2~0.45μm的过滤材料对所述细胞培养上清液进行过滤。
[0012]优选地，M2巨噬细胞培养上清液的制备方法，其特征在于，所述细胞培养诱导物采用10ng/ml的 IL
‑
4进行步骤（2）所述的诱导。
[0013]优选地，多肽水凝胶支架具有纳米纤维结构。
[0014]优选地，多肽水凝胶支架具有水凝胶的形态，调节后凝胶的pH为6.9~7.2，浓度为0.5wt%
‑
4wt%。
[0015]本专利技术的又一方面是提供上述的制备的水凝胶支架在体外培养神经雪旺细胞中的用途，其特征在于，所述支架促进神经雪旺细胞的生长和活性。
[0016]采用本专利技术的任一项所述的方法制备的多水凝胶支架在组织工程再生中的用途，其特征在于，所述支架促进损伤神经的再生。
[0017]本专利技术的有益效果是：1. 通过化学修饰和自组装方法制备组份更加明确，功能性更强，安全性和效率更高的多肽水凝胶支架，具有的纳米结构更适宜损伤神经的修复，增强特异性神经细胞再生速度，改善临床治疗效果。
[0018]2.合成含有不同神经生长因子模拟肽的序列，通过自组装技术制备水凝胶，进一步合成含有M2巨噬细胞条件培养条件的水凝胶支架，促进再生细胞协同治疗方向发展。
[0019]3.还可以选择不同多肽载体，不同神经生长因子模拟肽，针对不同神经细胞设计、制备个多肽水凝胶支架。
[0020]4.适宜的再生免疫环境仿生支架具有良好的神经细胞黏附和生长性能，适宜的组织相容性，纳米纤维接近于细胞外基质结构，采用本专利技术的方法制备的支架具有更好的再生微环境，为开发产品奠定基础。
附图说明
[0021]图1为示出自组装肽序列通过共价键键合神经生长因子模拟肽的结构模式图。
[0022]图2为示出诱导M2巨噬细胞显微镜下形态图。
[0023]图3为示出M2巨噬细胞成熟度的流式细胞检测图。其中，示出了通过流式细胞术检测到CD206的表达百分比。
[0024]图4为示出多肽水凝胶支架的透射电镜图。其中，示出了纳米纤维的结构。
[0025]图5为示出多肽水凝胶支架的倾斜实验图。
[0026]图6为原代培养神经雪旺细胞显微镜下形态图。
[0027]图7为示出经对照组培养的神经雪旺细胞和经多肽水凝胶支架培养的神经雪旺细胞的生长速度。其中，*代表P<0.05。
具体实施方式
[0028]除非另有定义，否则本文使用的科技术语具有与本专利技术所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。参见例如Singleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.，J. Wiley & Sons （New York，NY 1994）；Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Press（Cold Springs Harbor，NY 1989）。
[0029]本领域技术人员将认识到可用于实施本专利技术的、与本文描述的方法和材料类似或等同的许多方法和材料。实际上，本专利技术并不限于本文所描述的方法和材料，而是可基于本专利技术的精神，进行各种常规调整或修改，并且调整或修改后的方案仍落入了本专利技术的保护范围之内。
[0030]除非上下文明确地指出，否则本文所使用的术语“一个”和“一种”等涵盖了复数的对象。
[0031]在本文中，通过术语“约”修饰的对象涵盖了由于测量误差等引起的误差范围内的近似值。
[0032]在本文中，除非另有定义，所使用的术语“肿瘤微环境”是指肿瘤细胞的发生及生活的内环境，具有低氧、低PH以及高压的特点，这些特点使得肿瘤微环境中存在大量的生长因子、细胞趋化因子和各种本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种键合功能多肽，其包含通过共价键键合的自组装肽序列和神经生长因子模拟肽，其中，所述自组装肽序列为RADARADARADARADA、KWKAKAKAKWK、EWEAEAEAE、FEFEFKFKK或QQKFQFQFEQQ，所述神经生长因子模拟肽为GGGIDKRHWNS。2.如权利要求1所述的键合功能多肽，其特征在于，所述自组装肽序列与神经生长因子模拟肽通过酰胺键或二硫键共价连接。3.如权利要求1或2所述的键合功能多肽，其特征在于，所述自组装肽序列与神经生长因子模拟肽的摩尔比为（1~3）：1。4.权利要求1
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3...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨鹏翔，杨宇民，接晶，张鲁中，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：