一种食蟹猴的未成熟卵母细胞和胚胎的体外培养液及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种食蟹猴的未成熟卵母细胞和胚胎的体外培养液及其应用，在商品化的基础培养液TL

【技术实现步骤摘要】
一种食蟹猴的未成熟卵母细胞和胚胎的体外培养液及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种食蟹猴的未成熟卵母细胞和胚胎的体外培养液及其应用。

技术介绍

[0002]哺乳动物卵母细胞体外培养(in viro
‑
muartation，IVM)结合胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)及胚胎培养(culture in vitro，IVC)已经广泛应用于基础研究、家畜类动物、非人灵长类动物的体外胚胎生产，以及临床上不孕不育症的治疗。
[0003]对于人类而言，可以为许多由于疾病导致的不孕患者提供生育机会，并且IVM有减少费用、简化治疗程序、减少促排卵药物的作用等。对非人灵长类动物来说，IVM可产生大量的胚胎，以供胚胎移植、胚胎冷冻、核移植、嵌合、性别鉴定、胚胎分割和转基因等生物工程技术的研究和开发。
[0004]虽然食蟹猴和恒河猴生殖生理方面均与人很相似，但是，恒河猴的生殖受季节的影响极大，而生殖特性不受季节影响的食蟹猴就成为转基因动物模型建立的青睐对象。然而，近几年灵长类动物资源的越来越缺乏，特别是新型冠状病毒疾病爆发以来，非人灵长类动物的需求量急剧增加，导致该物种的数量也急剧下降。另外有研究表明，不管在人类和动物，与体内成熟卵母细胞相比，未成熟卵母细胞(包括GV期和MⅠ期)ICSI后受精率和妊娠率比常规成熟卵母细胞ICSI后受精率和妊娠率要低得多。我们前期在对食蟹猴的研究中也发现相同的问题：食蟹猴的IVM和体内自然成熟卵母细胞在ICSI后受精率、卵裂率和优胚率方面有显著差异。因此把经过促排卵之后获得的大量GV、MⅠ期卵母细胞进行体外培养(IVM)，并且提高成熟率及后期获得更多的胚胎以至后代，这对于保护这种珍贵的遗传资源具有重要意义。
[0005]食蟹猴的生殖特性不受季节的影响，一年四季都可以排卵繁殖，因此在国内外研究领域应用广泛，但是相比于恒河猴，食蟹猴的卵母细胞显得较脆弱，在体外培养更难，获优胚胎率低于恒河猴。
[0006]然而，市场上没有商品化的非人灵长类动物卵母细胞或者胚胎的培养液，更没有针对食蟹猴卵母细胞或者胚胎的培养液，目前以自配的培养液同时培养食蟹猴和恒河猴的卵母细胞及胚胎，发现食蟹猴的卵母细胞体外成熟率及胚胎发育率均低于恒河猴。

技术实现思路

[0007]为解决上述问题，本专利技术提供一种食蟹猴的未成熟卵母细胞和胚胎的体外培养液及其应用，在卵母细胞体外成熟培养液中添加猴血清进行培养GV、MⅠ期卵母细胞培养，提高未成熟卵母细胞发育率及胚胎分化率。
[0008]本专利技术通过下列技术方案实现：一种食蟹猴的未成熟卵母细胞和胚胎的体外培养液：包括基础培养液和组合营养剂，
[0009]所述基础培养液为5mL的TL
‑
FERT；
[0010]所述组合营养剂包括占基础培养液5
‑
10％的FBS(Fetal Bovine Serum)、5％的食蟹猴血清、1
‑
2％的100
×
非必须氨基酸、2
‑
4％的50
×
必须氨基酸。
[0011]所述TL
‑
FERT包括IVF
‑
TL、BSA(Bovine serum albumin)、丙酮酸钠(sodium pyruvate)、庆大霉素(gentamicin)和肝素(heparin)。TL
‑
FERT为常规市购产品，厂家名称：Caisson Labs，货号：IVL02
‑
100ML。
[0012]所述食蟹猴血清是将食蟹猴全血在4℃下放置2
‑
3小时后，以3000转/分的转速离心15分钟，把分离好的血清放入56℃灭活30min，再保存于
‑
20℃备用。
[0013]本专利技术的另一目的还在于提供一种食蟹猴的未成熟卵母细胞和胚胎的体外培养液的应用，经过下列步骤：
[0014](1)将食蟹猴的未成熟卵母细胞和胚胎的体外培养液移到培养皿中，每个培养皿中制作数个微滴，每个微滴为15
‑
20μL的培养液，培养液上方添加矿物油，将微滴置于37℃、5％CO2、5
‑
8％O2的培养箱中预热4小时及以上即能使用；
[0015](2)将食蟹猴卵泡液收集到含有8
‑
15IU/mL肝素钠的卵子洗涤液中，在解剖镜下收集卵丘复合物；
[0016](3)将卵丘复合物经透明质酸酶消化后去除颗粒细胞，观察卵母细胞成熟情况，挑出GV期、MⅠ期的未成熟卵母细胞，经TL
‑
hepes洗涤3次后转入微滴中培养，期间观察卵母细胞成熟情况，当发现成熟卵母细胞则进行ICSI；
[0017](4)ICSI之后的受精卵也移入另一个新的同样的微滴中培养。
[0018]所述步骤(1)的矿物油为常规市购产品，厂家名称：Sigma，货号：M8410
‑
1L，用量为每个35mm培养皿用2
‑
3mL。
[0019]所述步骤(2)的卵子洗涤液为TL
‑
HEPES+0.3％BSA(Bovine serum albumin)。
[0020]研究结果表明，本专利技术食蟹猴未成熟卵母细胞成熟率为86.21％，受精率为76.0％，优胚率为60.53％，与先前的研究的培养液相比，卵母细胞成熟率、受精率及胚胎发育分化率都有提高。是一种有效、经济的培养液，可推广至非人灵长类其它动物的未成熟卵母细胞及胚胎的培养。
[0021]食蟹猴未成熟卵母细胞的体外培养成熟可以为后期获得更多胚胎用于科学研究或者获得更多的子代动物的，食蟹猴可以避免生殖季节的局限性，提高研究工作效率，保证研究的稳定性和便捷性。因此，提高食蟹猴未成熟卵母细胞的体外培养成熟率及优胚率有重要的意义。
[0022]本专利技术具备的效果及优点：
[0023]1、与之前培养液相比，本专利技术的培养液适合用于食蟹猴IVF
‑
ET周期中未成熟卵母细胞体外培养成熟，也适合用于未成熟卵母细胞ICSI后获得的胚胎的体外培养，结果证明能提高未成熟卵母细胞的发育潜能，未成熟卵母细胞后续获得的优质胚胎率明显提高，能够显著提高食蟹猴未成熟卵母细胞的成熟率及后期胚胎的质量，使得促排卵之后获得的大量未成熟卵母细胞更有应用价值，同时也减少了雌性食蟹猴的用量，保护了物种资源。
[0024]2、用食蟹猴自体血清代替培养液中的部分胎牛血清，经济简便，可以促使胞核和胞质同步成熟，提高受精率。
具体实施方式
[0025]下面结合实例对本专利技术作进一步详细说明，但本专利技术保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。
[0026]实施例1
[0027]培养液配制：
[0028](1)将30mL食蟹猴全本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种食蟹猴的未成熟卵母细胞和胚胎的体外培养液：其特征在于：包括基础培养液和组合营养剂，所述基础培养液为5mL的TL
‑
FERT；所述组合营养剂包括占基础培养液5
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10％的FBS、5％的食蟹猴血清、1
‑
2％的100
×
非必须氨基酸、2
‑
4％的50
×
必须氨基酸。2.根据权利要求1所述的体外培养液：其特征在于：所述TL
‑
FERT包括IVF
‑
TL、BSA、丙酮酸钠、庆大霉素和肝素。3.根据权利要求1所述的体外培养液：其特征在于：所述食蟹猴血清是将食蟹猴全血在4℃下放置2
‑
3小时后，以3000转/分的转速离心15分钟，把分离好的血清放入56℃灭活30min，再保存于
‑
20℃备用。4.权利要求1至3任一体外培养液的应用，其特征在于经过下列步骤：(1)将食蟹猴的未成熟卵母细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄璋琼，范胜涛，马开利，唐东红，吴正存，江勤芳，李云，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：