一种从肠道体外模拟发酵体系中提取和检测奎因的方法技术

本发明专利技术一种从肠道体外模拟发酵体系中提取和检测奎因的方法，提取方法为：1）取肠道发酵液与Dowex 50（H

【技术实现步骤摘要】
一种从肠道体外模拟发酵体系中提取和检测奎因的方法


[0001]本专利技术属于化学分析
，具体涉及一种从肠道体外模拟发酵体系中提取和检测奎因的方法。

技术介绍

[0002]奎因（Queuine）是一种天然生化化合物，结构式为7
‑
（4,5
‑
顺式
‑
二羟基
‑1‑
环戊烯
‑3‑
基
‑
氨基
‑
甲基）
‑7‑
脱氮鸟嘌呤，也是鸟嘌呤的高度修饰碱基类似物。在真核生物体中，能通过tRNA转糖基化酶的催化作用，将tRNA反密码子34摆动位置上的第一位置的鸟嘌呤替换成奎因，从而形成奎因
‑
tRNA，这种tRNA修饰存在于四个特定tRNA——tRNA
Tyr
、tRNA
His
、tRNA
Asp
、tRNA
Asn
。
[0003]近十余年来，肠道体外模拟发酵体系不断地被开发、革新，国内外也已普遍采用肠道体外模拟发酵体系进行食品肠道微生物消化与评价研究，人体里的奎因来源主要有饮食摄入和肠道微生物合成，因此可以借助肠道体外模拟发酵体检研究肠道微生物合成奎因的相关性。由于肠道模拟发酵体系环境复杂，现有的提取方法对样本要求高、重现性较差，且提取率不足10%，现有的检测方法无法分离目标物与杂质，导致定量效果差的问题。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中存在的问题，本专利技术设计的目的在于开发一种能够从肠道体外模拟发酵体系中提取和检测奎因方法。该提取方法回收率高，该检测方法分离度好，且符合化学分析方法的要求。具体通过以下技术方案加以实现：一种从肠道体外模拟发酵体系中提取奎因的方法，包括以下步骤：1）取肠道发酵液样品与Dowex 50（H
+
）混合振荡，弃上清，将混有样品的Dowex 50转移至层析柱中；2）用去离子水润洗Dowex 50，去除颗粒表面的残留发酵液；3）依次用HCl、去离子水洗脱，并收集去离子水洗脱的洗脱液；4）用NH4OH洗脱，并收集NH4OH洗脱液，将NH4OH洗脱亚采用旋蒸的方式除去NH4OH；5）合并去离子水洗脱液和NH4OH洗脱液，采用冷冻干燥的方式除去洗脱液中的水，浓缩得奎因。
[0005]进一步地，步骤1）中肠道发酵液样品与Dowex 50的干重比为5mL:2g。
[0006]进一步地，步骤1）中混合振荡时间为1h，转速为100rpm。
[0007]进一步地，步骤3）和步骤4）中HCl、去离子水、NH4OH洗脱的用量比为2:1：3，流速均为10s/滴。
[0008]进一步地，步骤3）中HCl的物质的量浓度为1.5M，步骤4）中NH4OH的物质的量浓度为3M。
[0009]进一步地，步骤4）中旋蒸的温度为37℃，转速为60rpm。
[0010]一种奎因的检测方法，包括以下步骤：
1）将权利要求1制得奎因用去离子水复溶冷冻干燥后的样品，过膜后待用；2）采用高效液相色谱检测法，选用的色谱柱为 Venusil XBP C18（5μm，4.6
×
250 mm），紫外检测波长为254 nm，进样量为20μL，柱温为25℃，流速为 1mL/min，流动相为甲醇和10 mM甲酸铵，采用梯度洗脱。
[0011]进一步地，梯度洗脱的程序为：前5min保持甲醇为5%，5
‑
30min甲醇浓度逐渐升高至50%，30
‑
33min继续升高至80%，33
‑
45min降至5%。
[0012]本专利技术一种能够从肠道体外模拟发酵物中提取和检测奎因的方法，样本要求低，且提取率高、分离度高，能够满足肠道体外模拟发酵实验需求。
附图说明
[0013]图1为实施例2标准曲线图。
具体实施方式
[0014]以下结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明，以便更好地理解本技术方案。
[0015]实施例1称取2 g（干重）Dowex 50（H
+
），使用饱和食盐水，取其量等于被处理树脂体积的2
‑
3倍左右，将树脂置于食盐溶液中浸泡18
‑
20 h，然后将食盐水去除，用清水漂洗，使排出水不带黄色；再用用2%
‑
4%的氢氧化钠溶液，其用量和饱和食盐水量相同，将树脂在其中浸泡2
‑
4 h，放尽碱液后，冲洗树脂直至水排尽接近中性；最后用5%HCL溶液，其用量上述均相同，浸泡4
‑
8 h，放尽盐酸溶液，用清水漂洗至中性，待用。
[0016]将5mL样品与2 g（干重）Dowex 50（H+）混合后振荡1h（100 rpm）；弃上清，将Dowex 50转移至层析柱中；然后用5mL去离子水润洗Dowex 50；再用20mL 1.5 M HCl洗脱；接着用10mL去离子水洗脱并回收洗脱液；最后用30mL 3 M NH4OH洗脱，并回收洗脱液，采用旋蒸的方式（37℃，60 rpm）除去NH4OH；合并去离子水洗脱液和旋蒸后的液体，采用冷冻干燥的方式除去水；用1mL的去离子水复溶冷冻干燥后的样品，0.22 μm过膜后待检测。洗脱步骤流速均控制在10 s/滴。
[0017]实施例2检测采用高效液相色谱检测法，选用的色谱柱为 Venusil XBP C18（5μm，4.6
×
250 mm），紫外检测波长为254nm，进样量为20μL，柱温为25℃，流速为 1mL/min，流动相为甲醇和10 mM甲酸铵，采用梯度洗脱，程序为：前5min保持甲醇为5%，5
‑
30min甲醇浓度逐渐升高至50%，30
‑
33min继续升高至80%，33
‑
45min降至5%。
[0018]本专利技术上述提取和检测方法的奎因回收率为70.26%
±
0.69%，优化后的检测方法根据GB/T 27417
‑
2017中化学分析方法确认的要求对方法特性参数进行试验，在0.1 μg/mL～2.5 μg/mL范围内标准曲线为y=32255x
‑
330，R2=0.9996，检出限为0.052 μg/mL，定量限为0.156μg/mL，方法准确度（回收率）为97%左右，方法精密度（变异系数）符合化学分析标准中的要求，此检测方法很好地满足了肠道模拟发酵体系中及人体排泄物中的检测。其中，标准曲线见图1所示。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从肠道体外模拟发酵体系中提取奎因的方法，其特征在于，该提取方法包括以下步骤：1）取肠道发酵液样品与Dowex 50（H
+
）混合振荡，弃上清，将混有样品的Dowex 50转移至层析柱中；2）用去离子水润洗Dowex 50，去除颗粒表面的残留发酵液；3）依次用HCl、去离子水洗脱，并收集去离子水洗脱的洗脱液；4）用NH4OH洗脱，并收集NH4OH洗脱液，将NH4OH洗脱亚采用旋蒸的方式除去NH4OH；5）合并去离子水洗脱液和NH4OH洗脱液，采用冷冻干燥的方式除去洗脱液中的水，浓缩得奎因。2.如权利要求1所述的一种从肠道体外模拟发酵体系中提取奎因的方法，其特征在于步骤1）中肠道发酵液样品与Dowex 50的干重比为5mL:2g。3.如权利要求1所述的一种从肠道体外模拟发酵体系中提取奎因的方法，其特征在于步骤1）中混合振荡时间为1h，转速为100rpm。4.如权利要求1所述的一种从肠道体外模拟发酵体系中提取奎因的方法，其特征在于步骤3）和步骤4）中HCl、去离子水、NH4OH洗脱的用量比为2:1：3，流速均为10s/滴。5.如权利要求1所述的一种从...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱炫，郑谊青，向沙沙，葛茵，张亚林，张琴，夏燕婷，韩昊颖，陈杰，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：