CHO-S细胞残留蛋白检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物医学分析领域，公开了CHO

【技术实现步骤摘要】
CHO
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S细胞残留蛋白检测试剂盒及其制备方法


[0001]本专利技术涉及生物医学分析领域，具体涉及一种用于CHO
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S细胞残留蛋白检测试剂盒及其制备方法。

技术介绍

[0002]CHO细胞全称：中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovarian,CHO)，该细胞表达的蛋白最接近于天然蛋白分子，产物胞外分泌但很少分泌自身内源蛋白，对目标蛋白分离纯化工作十分有利，是目前在单抗和重组蛋白类生物制品中被广泛使用的工程细胞，CHO细胞表达系统具有表达遗传背景清楚、表达系统完善稳定、蛋白表达水平较高等优势。CHO分泌的内源蛋白很少但是仍然会有少量蛋白残留在生物制品的半成品和成品中。残留在生物制品中的宿主细胞蛋白(host cell protein，HCP)属于异源蛋白，既包括宿主细胞的结构蛋白液也包括宿主细胞(传代细胞)分泌的促生长因子。HCP不仅有可能诱导机体产生抗HCP抗体，引起机体产生过敏反应，还有可能有“佐剂效应”而引起机体对蛋白质药物产生抗体，影响药物治疗效果。因此，生物医药企业在质控环节必须对生产的半成品或成品的HCP进行定量测定。
[0003]目前，用于HCP测定的方法主要是ELISA法，ELISA方法作为一种经典的方法，因其高灵敏度和特异性被广泛应用。药典2020版规定药物中宿主细胞蛋白质残留量用酶联免疫吸附法测定，应不高于蛋白质总量的0.01％。商品化ELISA试剂盒在制备时消除不同CHO细胞系引起的HCP的差异，从而适用于一系列重组CHO细胞系。但研究表明，目前ELISA试剂盒在使用过程中存在如下的问题：1、不同检测试剂盒之间结果存在较大偏差；2、同一检测试剂和替换标准品后测得结果有较大差异；3、标准品的组成成分和比例存在较大差异。因此，亟需开发一种CHO细胞残留蛋白检测专用试剂盒。

技术实现思路

[0004]本专利技术意在提供一种用于CHO
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S细胞残留蛋白检测试剂盒及其制备方法，以解决现有技术中使用ELISA试剂盒检测CHO
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S HCP时存在的检测结果差异大，宿主蛋白覆盖率低，检测精度低的问题。
[0005]为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：CHO
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S细胞残留蛋白检测试剂盒，包括包被有抗HCP蛋白抗体的酶标板、生物素标记的IgG、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素和辅助制剂。
[0006]另一方面，本技术方案还提供CHO
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S细胞残留蛋白检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
[0007]步骤I：取CHO
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S宿主细胞蛋白免疫原，用PBS透析过夜，并定量检测总蛋白量；
[0008]步骤II：将部分HCP免疫原在兔子身上进行免疫接种产生抗体，其余HCP免疫原进行冻干处理并作为标准品；
[0009]步骤III：定量检测总蛋白量后，调整HCP免疫原蛋白浓度至2～20mg/mL，低温下保
存备用；
[0010]步骤IV：使用步骤II所得抗体进行扩大免疫，得抗HCP蛋白抗体，并在96孔板上包被HCP抗体；
[0011]步骤V：抗体生物素标记，IgG用PBS搅拌透析过夜后，在冰面上用生物素标记；更换新鲜的PBS，继续透析，得生物素标记的IgG，于低温下储存备用；
[0012]步骤VI：检测应用。
[0013]本方案的原理及优点是：本技术方案获得了CHO
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S细胞残留蛋白检测专用试剂盒，而且该试剂盒检测的灵敏度高，非常适合于推广应用。在制备该试剂盒时，首先将获取的HCP免疫原透析过夜，以去除污染小分子，避免影响BCA方法定量检测总蛋白量；而后将部分HCP免疫原在兔子身上进行免疫接种产生抗体，另一部分进行冻干处理并送返Genrixbio作为CHO
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S HCP ELISA标准品。为了保证HCP蛋白抗体的浓度，对其进行扩大免疫，HCP蛋白抗体的浓度对试剂盒检测精准度有重要影响。在制备生物素标记的IgG时，通过对操作方法及参数的优化，能够可能地移除多余生物素，这对降低ELISA背景干扰至最低程度十分关键，会明显影响ELISA检测方法的灵敏度。本技术方案通过对抗体生成与蛋白浓度调整以及抗体生物素标记步骤的优化，不获得了CHO
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S细胞残留蛋白检测专用试剂盒，而且保证了该试剂盒检测的灵敏度。
[0014]优选的，作为一种改进，生物素标记的IgG按照1:200～6400的比例稀释后使用，稀释液为pH7.4的含0.2％～1％BSA磷酸盐
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吐温缓冲液。
[0015]本技术方案中，生物素标记的IgG以上述比例稀释后，能够满足后续的检测需求，稀释液以磷酸盐
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吐温缓冲液为宜。
[0016]优选的，作为一种改进，辅助制剂包括：pH9.6的碳酸盐缓冲液、TMB显色液、终止液，终止液为硫酸或盐酸。
[0017]优选的，作为一种改进，步骤I中，用PBS透析过夜的条件为在4℃下搅拌24h。
[0018]本技术方案中，用pH7.4的预冷PBS缓冲液透析过夜的条件为在4℃下搅拌24h，以保证HCP蛋白活性、促进杂质等小分子的解吸，减少对后续检测和定量步骤的影响。
[0019]优选的，作为一种改进，步骤IV中，扩大免疫接种动物为兔，免疫接种采用多部位肌肉注射，第一针时，每1mL免疫原与1mL弗氏完全佐剂混合；后续针次，每1mL免疫原与1mL弗氏非完全佐剂混合；免疫接种程序持续98天。
[0020]本技术方案中，选择兔子与其他动物相比，兔子提供了优质的抗CHO
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S HCP抗体，并且由于兔子个体小血量少，采用多只兔子以增加个体多样性、获得免疫抗体的群体多样性。上述的免疫接种程序为经过试验验证的较优条件。
[0021]优选的，作为一种改进，步骤V中，生物素与IgG的摩尔比为5～20:1。
[0022]本技术方案中，上述生物素与IgG的摩尔比可以避免纯化过程中残留多余的游离生物素分子对生物素标记抗体的活性和检测使用产生影响。实际使用时，也可优化为10:1，摩尔比更小可以避免纯化过程中残留多余的游离生物素分子。
[0023]优选的，作为一种改进，CHO
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S细胞残留蛋白检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
[0024]S1：用CHO
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S HCP抗体包被酶标板；
[0025]S2：向包被后的酶标板中加入待检测样品和标准品溶液，孵育、洗涤；
[0026]S3：向S2洗涤后的酶标板中加入生物素标记的IgG，孵育、洗涤；
[0027]S4：向S3洗涤后的酶标板中加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，孵育、洗涤；
[0028]S5：向S4洗涤后的酶标板中加入显色液显色，孵育，加入终止液终止反应，于450nm波长下测定吸收度值。
[0029]本技术方案中，该试剂盒在使用时步骤简单，操作方便。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.CHO
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S细胞残留蛋白检测试剂盒，其特征在于：包括包被有抗HCP蛋白抗体的酶标板、生物素标记的IgG、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素和辅助制剂。2.根据权利要求1所述的CHO
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S细胞残留蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述生物素标记的IgG按照1:200～6400的比例稀释后使用，稀释液为pH7.4的含0.2％～1％BSA磷酸盐
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吐温缓冲液。3.根据权利要求2所述的CHO
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S细胞残留蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述辅助制剂包括：pH9.6的碳酸盐缓冲液、TMB显色液、终止液，终止液为硫酸或盐酸。4.根据权利要求1
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3任意一项所述的CHO
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S细胞残留蛋白检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤I：取CHO
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S宿主细胞蛋白免疫原，用PBS透析过夜，并定量检测总蛋白量；步骤II：将部分HCP免疫原在兔子身上进行免疫接种产生抗体，其余HCP免疫原进行冻干处理并作为标准品；步骤III：定量检测总蛋白量后，调整HCP免疫原蛋白浓度至2～20mg/mL，低温下保存备用；步骤IV：使用步骤II所得抗体进行扩大免疫，得抗HCP蛋白抗体，并在96孔板上包被HCP抗体；步骤V：抗体生物素标记，IgG用PBS搅拌透析过夜后，在冰面上用生物素标记；更换新鲜的PBS，继续透析，得生物素标记的IgG，于低温下储存备用；步骤VI...

【专利技术属性】
技术研发人员：常志远，边琳，张鑫，王威，
申请(专利权)人：重庆智翔金泰生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：