基于CRISPR/Cas12a集成MXenes的荧光生物传感器及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR/Cas12a集成MXenes的荧光生物传感器及其制备方法与应用，属于食品检测的技术领域。本发明专利技术利用CRISPR/Cas12a和MXenes构建了一种荧光生物传感器，包括Apt

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR/Cas12a集成MXenes的荧光生物传感器及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及食品检测领域，特别涉及一种基于CRISPR/Cas12a集成MXenes的荧光生物传感器及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]黄曲霉毒素B1(AFB1)是由黄曲霉菌(Aspergillus flavus)，寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)等丝状真菌产生的有毒代谢产物。AFB1因其致癌性、诱变性、致畸性等被国际癌症研究机构(International Agency for Research onCancer，IARC)归为一类致癌物。谷物、坚果、花生和玉米中AFB1的污染严重威胁着人类和动物的健康，也给全球农业带来了巨大的经济负担。目前为止，AFB1大多通过常规分析方法检测，包括色谱法、色谱
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质谱联用法、免疫分析法等。虽然这些方法对AFB1的检测结果具有较高的准确性和重现性，但仍存在程序复杂、繁琐的预处理、需要熟练的操作人员、检测耗时长等问题，这极大地限制了它们在实际应用中的潜力。因此，对AFB1的准确、灵敏、高效检测提出了迫切的要求。
[0003]成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palinmic repeats，CRISPR)和CRISPR
‑
相关的Cas12a蛋白系统源于细菌和古菌抵御核酸入侵的适应性免疫系统，是识别和操纵核酸的最强大的分子机制之一，已经在生物传感器构建方面取得了革命性的创新。但目前构建的CRISPR
‑
Cas12a生物传感器大多基于核酸检测，且大多荧光信号传导依赖于标记在单链DNA(ssDNA)两端的荧光团和猝灭团。然而，由于传统淬灭剂的猝灭效率有限，荧光背景信号相对较高。
[0004]MXenes作为一种新兴的二维金属碳化物，是生物传感器中极好的生物界面。MXenes可以有效吸附荧光团修饰的ssDNA并有效猝灭荧光团的荧光，这不仅提高了生物传感器的灵敏度，也降低了建立方法的荧光背景信号。因此，基于CRISPR/Cas12a集成MXenes的荧光生物传感器在痕量检测小分子领域具有更大的应用潜力。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术的缺点和不足，本专利技术的首要目的在于提供一种基于CRISPR/Cas12a集成的MXenes的荧光生物传感器。本专利技术通过双AFB1适配体锁定激活剂的稳定结构，未激活的Cas12a和引导RNA(crRNA)复合体以及吸附在MXenes上的FAM荧光团修饰的ss DNA(ssDNA
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FAM)纳米传感体系。AFB1存在时，AFB1优先与特异性的适配体结合，从而释放出激活剂。释放的激活剂能激活Cas12a/crRNA的反式切割任意ssDNA的活性，使得ssDNA
‑
FAM片段被切割成碎片而远离MXenes，导致荧光恢复。由于荧光输出信号与激活剂浓度呈正相关，通过观察荧光强度可以间接定量AFB1的浓度。本专利技术荧光生物传感器可以解决现有技术中样品处理复杂、特异性不高、灵敏度不够和检测时间长等问题。该荧光生物传感平台不仅成功用于AFB1的灵敏和特异性检测，而且可以扩展到其他小分子的检测。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供上述基于CRISPR/Cas12a集成的MXenes的荧光生物传感器的应用。方法操作简单、实验流程短，特异性高和灵敏度高。
[0007]本专利技术的目的通过以下技术方案实现：
[0008]一种基于CRISPR/Cas12a集成的MXenes的荧光生物传感器，包括组件1、组件2和组件3；其中：
[0009]所述组件1包括双适配体和激活剂；所述双适配体和激活剂均为ssDNA序列；
[0010]所述双适配体包括Apt
‑
1和Apt
‑
2，Apt
‑
1和Apt
‑
2是分别在靶分子适配体的3'一端和5'一端补充一些碱基获得的、均含有靶分子特异性结合的一段序列的两条不同单链；其中，碱基的添加个数以所得Apt
‑
1和Apt
‑
2分别与激活剂杂交的熔化温度高于环境温度25℃为准，优选为4～6个；
[0011]所述激活剂是将Apt
‑
1的3'端10～15个碱基，以及Apt
‑
2的5'端10～15个碱基重新组合所得的序列的互补序列；
[0012]所述组件2包括LbCas12a和crRNA；
[0013]所述LbCas12a(Cpf1)蛋白是依赖于RNA引导的内切核酸酶，作为细菌适应性免疫系统的组成部分，能结合crRNA并切割任意的ssDNA；
[0014]所述crRNA序列由直接重复序列和间隔序列两部分组成，其中直接重复序列会形成一个茎环结构，是与LbCas12a结合的序列，为UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU，间隔序列与激活剂序列碱基互补配对，其序列长度为20～30个碱基，优选为23～27个碱基；
[0015]所述组件3包括MXenes和ssDNA
‑
FAM；
[0016]所述ssDNA
‑
FAM是指含有FAM荧光团修饰的ssDNA；
[0017]所述ssDNA是含有19个碱基的非发夹结构ssDNA序列；
[0018]进一步地，所述靶分子范围广泛，只要靶标有对应的特异性适配体，从细菌到生物标志物，金属离子等；特别是各种生物毒素，包括但不限于卡那霉素、内毒素、微囊藻毒素以及真菌毒素；其中，真菌毒素包括但不限于黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A。本专利技术的CRISPR/Cas12a集成的MXenes的新型荧光生物传感器可超灵敏和特异性检测AFB1，特别是高效检测AFB1。
[0019]当所述靶分子为黄曲霉毒素B1时：
[0020]所述适配体的序列为：5
′‑
GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC
‑3′
；
[0021]所述Apt
‑
1的序列为：5
′‑
GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCTTGTGT
‑3′
；
[0022]所述Apt
‑
2的序列为：5
′‑
GTTTGTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC
‑3′
；
[0023]所述激活剂的序列为：5
′‑
GTGCCCAACAAAC/ACACAAGGGCCTAG
‑3′
；
[0024]所述crRNA的序列为：5
′‑
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas12a集成的MXenes的荧光生物传感器，其特征在于：包括组件1、组件2和组件3；其中：所述组件1包括双适配体和激活剂；所述双适配体和激活剂均为ssDNA序列；所述双适配体包括Apt
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1和Apt
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2，Apt
‑
1和Apt
‑
2是分别在靶分子适配体的3'一端和5'一端补充一些碱基获得的、均含有靶分子特异性结合的一段序列的两条不同单链；其中，碱基的添加个数以所得Apt
‑
1和Apt
‑
2分别与激活剂杂交的熔化温度高于环境温度25℃为准；所述激活剂是将Apt
‑
1的3'端10～15个碱基，以及Apt
‑
2的5'端10～15个碱基重新组合所得的序列的互补序列；所述组件2包括LbCas12a和crRNA；所述LbCas12a蛋白是依赖于RNA引导的内切核酸酶，作为细菌适应性免疫系统的组成部分，能结合crRNA并切割任意的ssDNA；所述crRNA序列由直接重复序列和间隔序列两部分组成，其中直接重复序列会形成一个茎环结构，是与LbCas12a结合的序列，为UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU，间隔序列与激活剂序列碱基互补配对，其序列长度为20～30个碱基；所述组件3包括MXenes和ssDNA
‑
FAM；所述ssDNA
‑
FAM是指含有FAM荧光团修饰的ssDNA；所述ssDNA是含有19个碱基的非发夹结构ssDNA序列。2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a集成的MXenes的荧光生物传感器，其特征在于：所述靶分子为有对应的特异性适配体的细菌、生物标志物或金属离子；进一步为卡那霉素、内毒素、微囊藻毒素或真菌毒素；更进一步为黄曲霉毒素B1或赭曲霉毒素A。3.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a集成的MXenes的荧光生物传感器，其特征在于：所述靶分子为黄曲霉毒素B1；所述适配体的序列为：5
′‑
GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC
‑3′
；所述Apt
‑
1的序列为：5
′‑
GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCTTGTGT
‑3′
；所述Apt
‑
2的序列为：5
′‑
GTTTGTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC
‑3′
；所述激活剂的序列为：5
′‑
GTGCCCAACAAAC/ACACAAGGGCCTAG
‑3′
；所述crRNA的序列为：5
′‑
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU/CUAGGCCCUUGUGUGUUUGUUGGG
‑3′
。4.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a集成的MXenes的荧光生物传感器，其特征在于：所述MXenes为Ti3C2Tx，即碳化钛纳米片，其片径大小为0.5～4μm。5.根据权利要求1～4任一项所述的基于CRISPR/Cas12a集成的MXenes的荧光生物传感器，其特征在于：所述组件1为双适配体和激活剂进行杂交反应获得的“锁定激活剂”系统；所述组件2为LbCas12a和crRNA进行偶联反应获得的未激活Cas12a/crRNA复合物；所述组件3为ssDNA
‑
FAM在氢键作用下吸附在MXenes纳米片上获得的荧光报告分子。
6.根据权利要求5所述的基于CRISPR/Cas12a集成的MXenes的荧光生物传感器，其特征在于：所述杂交反应在1
×
TOLO 3缓冲液中进行；所述杂交反应的体系中，Apt
‑
1或Apt
‑
2的浓度为10～30nM；激活剂的浓度为1～20nM；Apt
‑
1或Apt
‑
2和激活剂的杂交比为5：1～1：5...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙大文，伍智慧，蒲洪彬，韦庆益，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：