一株高效外泌蛋白的酵母工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一株高效外泌蛋白的酵母工程菌及其构建方法和应用，该酵母基因工程菌是敲除酵母菌株中的SEC72基因后得到的；所述的酵母基因工程菌还含有携带信号肽的重组蛋白分泌表达质粒；所述信号肽是NCW2、MID2、SWP1、FET3、FLO10或α

【技术实现步骤摘要】
一株高效外泌蛋白的酵母工程菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及一株高效外泌蛋白的酵母工程菌及其构建方法和应用，属于微生物及基因工程领域。

技术介绍

[0002]酿酒酵母是单细胞真核生物，兼具真核生物及微生物的优势。其生长繁殖快、易于进行基因工程改造、能进行蛋白翻译后修饰、具有较强环境耐受性及底物利用谱广等特点，已被广泛地应用在重组蛋白工业生产上。如胰岛素、病毒疫苗生产等。基于酿酒酵母应用的普适性，对酿酒酵母的基因信息和蛋白质表达等展开了大量研究，如酿酒酵母是首个实现基因组测序的真核生物，其多年前便用于胰岛素的生产。目前，全球近一半的胰岛素仍以酿酒酵母为生产平台进行供应。
[0003]利用真核生物进行重组蛋白制备时，宿主细胞以分泌形式进行蛋白表达是较受欢迎的一种方式。因为这可促使目标蛋白在经过分泌途径而外泌至胞外的过程中，得到适当的翻译后修饰，保证重组蛋白具有生理活性。同时，外泌至胞外的重组蛋白也有利于进行下游纯化，极大地减轻了纯化环节的压力，有利于提升经济效益。目前，对于重组蛋白在酵母中的分泌表达，通常在目标蛋白的N端添加信号肽来实现介导分泌。尽管添加信号肽可实现外源蛋白的分泌，然而，部分外源蛋白在酵母系统中表达时分泌效率较低，这会限制酵母在大规模生产上的应用。通过基因改造手段，可以提升酵母的重组蛋白分泌能力。但目前很多改造的靶点，提升幅度较小，且有时只对特定的信号肽有效，导致适用性较为有限。目前在改造靶点及手段上，都有待进一步拓展完善。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一株高效外泌蛋白的酵母工程菌及其构建方法和应用，来解决现有改造靶点提升幅度小、对不同信号肽的普适性较窄的不足。本专利技术针对与介导分泌相关的分子伴侣复合体上的一个蛋白Sec72进行敲除，克服了现有技术的缺陷，实现了多种信号肽在酵母中介导蛋白分泌的能力都得到了较大提升。
[0005]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0006]一株酵母基因工程菌，是敲除酵母菌株中的SEC72基因后得到；
[0007]所述SEC72基因的序列如SEQ ID NO:2所示；
[0008]SEC72基因编码的Sec72蛋白，是介导分泌转运相关的一种分子伴侣复合体上的亚基之一；该分子伴侣复合体为内质网上的转运通道，可通过识别新生蛋白质的信号肽序列，将新生蛋白质从胞质中介导转运至内质网中，随后新生蛋白质可在内质网中继续完成蛋白分泌后续步骤。Sec72蛋白参与信号肽序列识别过程。基于本专利技术，发现对其进行改造(敲除)，有助于完成新生蛋白质的内质网转运，从而提升了蛋白外泌的效率。
[0009]所述的酵母菌株优选酿酒酵母IMX581、CEN.PK2
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1C、CEN.PK2
‑
1D、BY4741、BY4742、CEN.PK 530.1C、CEN.PK 113.5D、B184M。
[0010]所述的酵母基因工程菌还含有携带信号肽的重组蛋白分泌表达质粒；
[0011]所述信号肽可以是NCW2、MID2、SWP1、FET3、FLO10或α
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factor中的一种；
[0012]所述的重组蛋白可以是α
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淀粉酶、脂肪酶、β
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淀粉酶、蛋白酶、乳糖酶、α
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葡萄糖苷酶、葡糖异构酶、转化酶、纤维素酶、纤维二糖酶、人血清白蛋白、病毒表面抗原、人胰岛素、人粒细胞集落刺激因子、人血管抑制素、抗体等。
[0013]优选地，所述的重组蛋白分泌表达质粒带有POT1筛选标记；这种情况下，还应当敲除酵母菌株中的TPI1基因，使重组蛋白分泌表达质粒在酵母菌稳定存在；
[0014]所述TPI1基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
[0015]上述酵母基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
[0016]敲除酵母菌株上的SEC72基因，构建携带信号肽的重组蛋白分泌表达质粒，将携带信号肽的重组蛋白分泌表达质粒转化至敲除SEC72基因的酵母菌株中，得到所述酵母基因工程菌。
[0017]上述的酵母基因工程菌在表达重组蛋白中的应用；将上述酵母基因工程菌接种于发酵培养基中进行发酵培养，收集发酵培养产物即可得相应的重组蛋白。
[0018]本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0019]本专利技术构建了一株高效外泌蛋白的酿酒酵母工程菌，可使包括NCW2、MID2、SWP1、FET3、FLO10和α
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factor等在内的多种信号肽介导重组蛋白分泌的产量得到明显提高(1.7～2.5倍)。该酵母基因工程菌针对介导分泌相关的分子伴侣复合体进行改造，蛋白分泌能力提升对于多种信号肽具有普适性，为高效分泌表达目标蛋白提供奠定了基础。该酵母基因工程菌在重组蛋白分泌生产上展现出较大的应用潜力。
附图说明
[0020]图1为PCR扩增pROS10载体框架，TPI1靶向片段A和SEC72靶向片段B的凝胶电泳条带图。
[0021]图2为TPI1修复片段A和SEC72修复片段B的凝胶电泳条带图。
[0022]图3为TPI1基因敲除验证片段A和SEC72敲除验证片段B的凝胶电泳条带图。
[0023]图4为带不同信号肽的分泌表达α
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淀粉酶的质粒示意图。
[0024]图5为pAlphaAmyCPOT酶切条带凝胶电泳图。
[0025]图6为对照菌株S1和改造菌株S1ΔSEC72的分泌生产淀粉酶的产量。
具体实施方式
[0026]下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。
[0027]下述实施例中所用的PCR试剂、限制性内切酶、质粒抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒等采用商业产品多已注明商业来源，具体操作按照试剂盒说明书进行。
[0028]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，则通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南》(北京：科学出版社，2017)、《酵母遗传学方法实验指南》(北京：科学出版社，2016)中所述的条件进行。
[0029]下述实施例中应用到的CRISPR技术参见现有技术(FEMS Yeast Research，2015，
15(2):fov004.)。
[0030]为更好地理解本专利技术的内容，以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)IMX581(可由EUROSCARF获得，序号Y40593)为出发菌株，为具体实施例作进一步说明。
[0031]下列实施例中涉及到的培养基成分如下：
[0032]LB：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl。用于筛选转化质粒时，添加100μg/mL氨苄青霉素。
[0033]Se
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Ura：0.77g/L CSM
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Ura，6.9g/L YNB，0.5g/L葡萄糖，10ml乙醇。
[0034]YPE：20g本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株酵母基因工程菌，其特征在于：是敲除酵母菌株中的SEC72基因后得到；所述的酵母基因工程菌还含有携带信号肽的重组蛋白分泌表达质粒。2.根据权利要求1所述的酵母基因工程菌，其特征在于：所述SEC72基因的序列如SEQ ID NO:2所示。3.根据权利要求1所述的酵母基因工程菌，其特征在于：所述的酵母菌株为酿酒酵母IMX581、CEN.PK2
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1C、CEN.PK2
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1D、BY4741、BY4742、CEN.PK530.1C、CEN.PK 113.5D、B184M。4.根据权利要求1所述的酵母基因工程菌，其特征在于：所述信号肽是NCW2、MID2、SWP1、FET3、FLO10或α
‑
factor中的一种。5.根据权利要求1所述的酵母基因工程菌，其特征在于：所述的重组蛋白是α
‑
淀粉酶、脂肪酶、β
‑
淀粉酶、蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄明涛，薛松绿，肖楚凡，潘雨阳，刘秀妨，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：