使用人多潜能干细胞诱导获得脊髓谷氨酸能中间神经元的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种使用人多潜能干细胞诱导获得脊髓谷氨酸能中间神经元的方法及其应用，涉及多潜能干细胞分化诱导技术领域。本发明专利技术采用多组不同的小分子组合物，对人多潜能干细胞进行多个阶段的诱导分化，获得脊髓p3前体细胞，并通过成熟培养最终获得脊髓V3谷氨酸能中间神经元。采用本发明专利技术的这种方法，能够获得更高纯度的脊髓V3谷氨酸能中间神经元。更高纯度的脊髓V3谷氨酸能中间神经元。更高纯度的脊髓V3谷氨酸能中间神经元。

【技术实现步骤摘要】
使用人多潜能干细胞诱导获得脊髓谷氨酸能中间神经元的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及多潜能干细胞分化诱导
，特别涉及使用人多潜能干细胞诱导获得脊髓谷氨酸能中间神经元的方法和应用。

技术介绍

[0002]脊髓损伤(Spinal cord injury，SCI)层被描述为一种“无法医治”的疾病。随着当代神经生物学研究的不断进步，有望将这种模式从缓解转变为更具治疗性的干预措施。科研工作者们利用动物中的SCI模型研究中枢神经系统(Central nervous system，CNS)的功能，了解到脊髓中具有特征明确的上、下行束和各种形式的已经被明确定义的感觉输入，以及能够产生一系列可量化运动输出的自主环路。SCI后的中枢脊髓和周围神经病变已成为基本神经生物学研究的关键，在为SCI患者设计更有效、更具针对性的治疗策略中具有重要意义。
[0003]脊髓在受到损伤后，可一定程度上恢复各种感觉运动功能。完全性SCI后的运动恢复取决于内在固有的脊髓环路(CPG)能够按照复杂的顺序激活各种腿部肌肉以产生动作，这个过程是通过CPG与腿部的感觉反馈协同实现。SCI后，细胞和环路特性会发生不同变化，可以通过药理、电(生理)或康复策略促进恢复。在部分(或不完全)SCI后，后肢运动恢复可能是由其余备用路径(下行束/纤维)的再生或(重新)长出引起的，也可能是由在完全性SCI后观察到的内在机制引起的，即脊髓固有环路(CPG)和感觉输入的变化。
[0004]目前，大量研究工作集中在如何通过促进受损路径的再生，或通过未受损路径的侧支(重新)生长，促进功能性的接收，以重新连接病变的脊髓水平及其上段。在各种临床前研究和临床试验中已经评估了再生性干细胞疗法在靶向SCI治疗中的应用。这些研究表明，干细胞具有自我更新和分化为具有不同功能的细胞的能力，如神经细胞能够建立新的突触连接，释放各种神经营养因子，并提供适当的导电微环境，促进受损脊髓的某些修复并改善运动功能。尽管许多实验研究已经评估了干细胞在SCI治疗中的应用，但是干细胞治疗仍然远未达到有效的成果，仍然面临着几个重大挑战。例如，脊髓中移植的细胞的存活率非常低，目前的研究报道在脊髓内移植神经前体细胞可以达到相对其他干细胞类型较高的存活率，但尚不清楚这些细胞在SCI后的哪个阶段可以达到最佳效果；此外，在针对不同的损伤类型及对应症状时，如何选择确定最适合的干细胞类型，仍然存在争议。
[0005]在对脊髓运动控制的稳健性和节律性方面，两类兴奋性谷氨酸能SpINs(脊髓中间神经元，包括V2a SpINs和V3 SpINs)起着关键性的作用。关于V2a SpINs在改善动物SCI后运动功能方面的作用已经发表了相关文章，证明SCI后V2a SpINs前体细胞的移植可以提供一种恢复脊髓内在环路神经元之间的功能连接的新疗法，以显著改善运动功能。而作为另一个重要的兴奋性谷氨酸能SpINs群体，Sim1阳性的V3 SpINs在V1 Ia上形成24％的谷氨酸能连接，在Renshaw亚类上形成27％，在侧脑运动柱运动神经元上形成22％的谷氨酸能突触，在Lhx3阳性的V2 SpINs及第
Ⅷ
板层连合性SpINs上形成连接。研究表明，在行为学上，通
过破伤风毒素或咽侧体抑制素信号传导导致V3 SpINs活性丧失后，会导致CPG稳健性的丧失，并显示间歇或永久性跳跃步态。V3 SpINs还可以平衡脊髓两半之间的运动输出，确保步行过程中运动活动的对称模式。V3 SpINs通过在脊髓的两半之间分配兴奋性驱动力，建立规则而平衡的运动节律。由此可见，这类神经元在脊髓运动输出中的重要作用。
[0006]目前，中国授权专利CN109554342B提供了一种诱导性多功能干细胞诱导获得脊髓GABA能中间神经元的方法，采用诱导性多功能干细胞在CHIR99021、SB431542和DMH1，以及环巴胺和视黄酸等的先后诱导作用下，获得脊髓GABA能中间神经元。但是，尚未发现有人利用多潜能干细胞诱导分化获得V3 SpINs，而现代医学伦理亦难以从原代的胚胎脊髓中提取p3前体细胞(即V3 SpINs的前体细胞)，这些都使得缺乏直接的来源以研究这类细胞的作用；同时，也尚未有人研究如何使用多能干细胞诱导获得脊髓p3前体细胞，并在体外成熟为V3谷氨酸能中间神经元(Sim1
+
，vGluT2
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)；也未有人研究在选择合适的SCI模型对实验动物造成了运动功能损伤后，移植外源性的脊髓p3前体细胞至损伤脊髓内，能否起到改善作用。

技术实现思路

[0007]针对以上现有技术研究的空白，本专利技术提供了使用人多潜能干细胞诱导获得脊髓谷氨酸能中间神经元的方法及其应用，运用小分子组合法，利用人多潜能干细胞在体外获得富集的V3 SpINs的前体细胞，即脊髓p3前体细胞，并以其在动物SCI模型中的功能验证作为基础，研究人类胚胎对脊髓p3前体细胞在人胚胎发育过程中的存在情况及其发生发育规律。具体通过以下技术实现。
[0008]使用人多潜能干细胞诱导获得脊髓谷氨酸能中间神经元的方法，包括以下步骤：
[0009]S1、使用人多潜能干细胞加至含有第一小分子组合物的诱导分化培养基中，诱导分化得到神经上皮细胞；所述第一小分子组合物包括GSK
‑
3抑制剂、TGF
‑
β/Smad抑制剂和BMP抑制剂；
[0010]S2、取步骤S1所得神经上皮细胞加至含有第二小分子组合物的模式化培养基中(实际试验操作时，可以将步骤S1的所有产物直接加入维持模式化培养基中，也可以通过某种技术先分离纯化出神经上皮细胞，再将其加入维持模式化培养基中)，诱导分化得到表达Nkx2.2
+
/Hoxb4
+
的脊髓p3前体细胞；所述第二小分子组合物包括BMP抑制剂、TGF
‑
β/Smad抑制剂、RAR核受体激活剂、Wnt通路抑制剂和Sonic hedgehog信号通路激动剂；
[0011]S3、取步骤S2所得表达Nkx2.2
+
/Hoxb4
+
的脊髓p3前体细胞加至含有第三小分子组合物的维持模式化培养基中悬浮培养(实际试验操作时，可以将步骤S2的所有产物直接加入维持模式化培养基中，也可以通过某种技术先分离纯化出表达Nkx2.2
+
/Hoxb4
+
的脊髓p3前体细胞，再将其加入维持模式化培养基中)，诱导分化得到表达Nkx2.2
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/Neurog3
+
的脊髓p3前体细胞；所述第三小分子组合物包括RAR核受体激活剂和Sonic hedgehog信号通路激动剂；
[0012]S4、取步骤S3所得表达Nkx2.2
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/Neurog3
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的脊髓p3前体细胞贴壁培养，进行神经营养使其成熟得到脊髓V3谷氨酸能中间神经元(实际试验操作时，可以将步骤S3的所有产物直接加入神经营养培养基中，也可以通过某种技术先分离本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.使用人多潜能干细胞诱导获得脊髓谷氨酸能中间神经元的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、使用人多潜能干细胞加至含有第一小分子组合物的诱导分化培养基中，诱导分化得到神经上皮细胞；所述第一小分子组合物包括GSK
‑
3抑制剂、TGF
‑
β/Smad抑制剂和BMP抑制剂；S2、取步骤S1所得神经上皮细胞加至含有第二小分子组合物的模式化培养基中，诱导分化得到表达Nkx2.2
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/Hoxb4
+
的脊髓p3前体细胞；所述第二小分子组合物包括BMP抑制剂、TGF
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β/Smad抑制剂、RAR核受体激活剂、Wnt通路抑制剂和Sonic hedgehog信号通路激动剂；S3、取步骤S2所得表达Nkx2.2
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/Hoxb4
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的脊髓p3前体细胞加至含有第三小分子组合物的维持模式化培养基中悬浮培养，诱导分化得到表达Nkx2.2
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/Neurog3
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的脊髓p3前体细胞；所述第三小分子组合物包括RAR核受体激活剂和Sonic hedgehog信号通路激动剂；S4、取步骤S3所得表达Nkx2.2
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/Neurog3
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的脊髓p3前体细胞贴壁培养，进行神经营养使其成熟得到脊髓V3谷氨酸能中间神经元。2.根据权利要求1所述的使用人多潜能干细胞诱导获得脊髓谷氨酸能中间神经元的方法，其特征在于，步骤S1的所述诱导分化培养基，包括体积比为1:1的DMEM/F
‑
12和Neurobasal，还包括体积分数1％的NEAA、体积分数1％的N
‑
2、3μM的GSK
‑
3抑制剂、2μM的TGF
‑
β/Smad抑制剂、2μM的BMP抑制剂混合配制而成。3.根据权利要求1所述的使用人多潜能干细胞诱导获得脊髓谷氨酸能中间神经元的方法，其特征在于，步骤S2的所述模式化培养基，包括体积比为1:1的DMEM/F
‑
12和Neurobasal，还包括体积分数1％的NEAA、体积分数1％的N
‑
2、体积分数2％的B27、2μM的BMP抑制剂、2μM的TGF
‑
β/Smad抑制剂、0.1μM的RAR核受体激活剂、Wnt通路抑制剂、1μM的Sonic hedgehog信号通路激动剂混合配制而成，所述Wnt通路抑制剂使用一种或两种，且每种所述Wnt通路抑制剂的浓度为2
‑
2.5μM。4.根据权利要求3所述的使用多潜能干细胞诱导获得脊髓谷氨酸能中间...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈红，黄晓琳，徐佳，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属同济医院，
类型：发明
国别省市：